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mRNA疫苗开发体外合成解决方案

近年来，mRNA技术的发展应用持续得到关注。mRNA药物以安全、高效、周期短等的优势，目前已经应用在疫苗、肿瘤免疫、罕见病等多个领域。近期，默沙东（MSD）与Moderna将于8月启动癌症疫苗mRNA-4157（V940）与PD-1疗法Keytruda组合在高风险黑色素瘤（II-IV期）患者身上的3期临床试验。mRNA药物在申报和临床上的不断传来的好消息，加强了研究者和患者对mRNA 药物发展的信心。

mRNA技术

mRNA（Messenger RNA或信使RNA）在人类生物学中起着基本作用，它转移存储在DNA中的指令来制活细胞所需的蛋白质。mRNA疫苗是将RNA在体外进行相关的修饰后传递至机体细胞内表达并产生蛋白抗原，从而导机体产生针对该抗原的免疫应答，进而扩大机体的免疫能力^[2,3]。mRNA疫苗分为非复制性mRNA(nonreplicating mRNA)和自扩增mRNA(self-amplifying mRNA)两类：自扩增mRNA不仅编码目标抗原，而且还编码能够使细胞内RNA扩增和蛋白表达的复制机制。非复制性mRNA疫苗仅编码目标抗原并包含5′和3′非翻译区（UTR），它们提供对适应性和先天免疫力的综合刺激，即原位抗原表达和危险信号传递。

mRNA疫苗开发流程包括病原体识别、测序、mRNA体外合成和修饰、纯化等操作。

图1. mRNA疫苗的示意图及其抗原表达的机制^[4]

图2. mRNA疫苗生产制备流程图[5]

mRNA体外合成

体外合成RNA（IVT）主要是以DNA为模板通过体外转录得到，常用的是以线性化质粒DNA或PCR扩增产物为模板利用RNA聚合酶在体外转录合成。主要过程是利用含有T7启动子（TAATACGACTCACTATAGGG）或SP6启动子（ATTTAGGTGACACTATAG）序列的DNA为模板在含有T7或SP6 RNA聚合酶的条件下，以NTP为底物合成与模板DNA中一条链互补的mRNA，简单快速获得大量的mRNA分子，通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾加强mRNA的稳定性。

图3. 体外转录（IVT）mRNA生产和装配过程^[6]

翌圣生物可以提供IVT的全套核心原料，且其中多款产品均已获得FDA DMF 备案。GMP级别的产品质量管理，符合ISO 13485体系，采用化学成分明确，无动物源和无人源性成分；采用大规模生产，可以常规的文件支持，通过稳定性检测，确保产品的高性能。

为保障优质酶的可持续供应，2021年底，翌圣生物基于多年分子酶研发与工业化生产的技术优势，在武汉东湖高新区光谷生物医药产业园新建mRNA 疫苗原料生产基地-mRNAtools, 总体建筑面积5000余平米。该基地配置两套1.5吨大型全自动发酵设备、工业级纯化与冻干设备等，结合先进的生产工艺，翌圣mRNA 疫苗原料的供应能力将逐步由10亿人份/每年提升到100亿人份/每年。

产品列表

流程	定位	产品名称	货号
体外转录（试剂盒）	RNA体外转录	Hifair^® T7 High Yield RNA Synthesis Kit	10623ES
体外转录（试剂盒）	一步法mRNA 体外转录	T7 High Yield RNA Synthesis Kit for Co-transcription	10673ES
体外转录（单组分）	限制性内切酶	BspQI GMP-grade (10 U/μL)	10664ES
		BsaI GMP-grade (20 U/μL)	10661ES
		10×Digestion buffer 3 GMP-grade	10667ES
	T7 RNA 合成酶	T7 RNA Polymerase GMP-grade（250 U/μL）	10625ES
	无机焦磷酸酶	Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade(1 U/μL)	10620ES
	无机焦磷酸酶	Pyrophosphatase, Inorganic GMP-grade (0.1 U/μL)	10672ES
	RNA 抑制剂	Murine RNase inhibitor GMP-grade (40 U/μL)	10621ES
	转录buffer	10×Transcription Buffer GMP-grade(Mg²⁺ free)	10669ES
	转录buffer	10× Transcription Buffer 2 GMP-grade	10670ES
	NTP	ATP Tris Solution GMP-grade (100 mM)	10652ES
		CTP Tris Solution GMP-grade (100 mM)	10653ES
		UTP Tris Solution GMP-grade (100 mM)	10654ES
		GTP Tris Solution GMP-grade (100 mM)	10655ES
		Pseudo UTP Tris Solution GMP-grade (100 mM)	10656ES
		N1-Me-Pseudo UTP Tris Solution GMP-grade (100 mM)	10657ES
DNA消化	模板DNA 消化	Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade	10611ES
RNA纯化	RNA纯化	Hieff NGS^® RNA Cleaner	12602ES
mRNA修饰	二步法加帽技术	mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade	10614ES
		mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase GMP-grade	10612ES
		10× Capping Buffer GMP-grade	10666ES
		Murine RNase inhibitor GMP-grade (40 U/μL)	10621ES
		GTP Tris Solution GMP-grade (100 mM)	10655ES
		S-adenosylmethionine (SAM)（32mM）	10619ES
	共转录帽类似物	Cap1-GAG m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG (100mM)	10677ES
		Cap1-GAG m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG(100 mM)	10678ES
		Cap AU-GAUm7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU GMP-grade (100 mM)	10679ES
	加尾酶	E.coli poly(A) Polymerase (5 U/μL）	1481ES
mRNA标准品	mRNA原液标准品	Firefly Luciferase-mRNA(3-O-Me-GAG, N1-Me-Pseudo UTP)	17101ES
		eGFP-mRNA(3-O-Me-GAG, N1-Me-Pseudo UTP)	17102ES
		OVA -mRNA(3-O-Me-GAG, N1-Me-Pseudo UTP)	17103ES
		mCherry-mRNA(3-O-Me-GAG, N1-Me-Pseudo UTP)	17104ES60/80
环状RNA	线性RNA 去除	RNase R (20U/μL)	14606ES

参考文献

[1]Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.

[2]苗鹤凡, 郭勇, 江新香. mRNA疫苗研究进展及挑战[J]. 免疫学杂志, 2016(05):446-449.

[3]Kramps T., Elbers K. (2017) Introduction to RNA Vaccines. In: Kramps T., Elbers K. (eds) RNA Vaccines. Methods in Molecular Biology, vol 1499. Humana Press, New York, NY.

[4]Verbeke, Rein & Lentacker, Ine & De Smedt, Stefaan & Dewitte, Heleen. (2019). Three decades of messenger RNA vaccine development. Nano Today. 100766. 10.1016/j.nantod.2019.100766.

[5]Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,

[6]Sergio Linares-Fernández, Céline Lacroix, ,Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response,Trends in Molecular Medicine,Volume 26, Issue 3,2020,Pages 311-323,

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