环状 RNA (circRNA)是一类单链闭合的环状RNA分子，与线性mRNA相比，circRNA具有稳定性高、免疫原性低、表达持久等优势，已经成为下一代RNA疗法赛道的新秀。将IVT得到的线性RNA进行环化是circRNA人工合成的关键环节，常用的环化策略包括Ⅰ型内含子自剪切、Ⅱ型内含子自剪切和T4 RNA连接酶策略。连接酶策略中最常用的便是T4 RNA Ligase 1。

图1. T4 RNA Ligase 1环化机理

T4 RNA Ligase 1是一种ATP依赖型连接酶，可以催化单链RNA、单链DNA、单核苷酸分子间或分子内的5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键。翌圣的T4 RNA Ligase 1由大肠杆菌重组表达，连接效率高，核酸酶残留水平低，可用于RNA与RNA分子间连接/分子内连接（RNA环化）、miRNA文库构建中的5'端接头的连接、5'-RACE (cDNA末端快速扩增)中将寡核苷酸连接到单链cDNA中等应用。

图2. T4 RNA Ligase 1连接类型示意图

图3. 切口酶残留检测

将30 U翌圣及进口品牌N*的T4 RNA Ligase 1与底物DNA孵育，琼脂糖凝胶电泳比较DNA谱带变化。结果显示翌圣3个批次的T4 RNA Ligase 1切口酶残留显著低于进口品牌N*。

图4. 外切酶残留检测

图5. RNase残留检测