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干货 | 关于蛋白Marker的二三事,你都了解吗?

在聚丙烯酰胺凝胶电泳实验中,蛋白Marker的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小,只有标准量精确无误了,实验结果才有说服力,除此之外,蛋白Marker还有表示蛋白在凝胶上的电泳程度或转移成功等的作用,所以选择正确的蛋白Marker也是western blot实验成功的必要条件之一。

 

 
蛋白Marker发展旅程
 

 

非预染蛋白Marker需要染色后才可见,并且使用天然蛋白组成的Marker(如Cat#20313)每次上样前需要煮沸使蛋白充分变性和还原,重组蛋白组成的Marker(如Cat#20312)储存液中的DTT若被氧化,可能会出现一些杂带,此时需加入新的DTT,操作不方便,因此发展了预染蛋白Marker。

 

预染蛋白Marker在多肽的某些氨基酸残基侧链基团共价连接染料基团,这样不仅可以监控电泳过程和电泳质量,还可通过条带色彩直观估计蛋白分子量大小及蛋白质转膜效果,即开即用,无需加热、稀释和添加还原剂,因此得到了广泛应用。

 

 

翌圣预染蛋白Marker
 
 
采用均一序列组成的大肠杆菌重组蛋白质(专门切掉His标签),通过均一定点标记而成,具有如下突出优点:

 

颜色鲜明 — 三色预染,每条条带平均浓度2.5 μg/5 uL
偏移率低 — 不同的跑胶缓冲液中,蓝色基本稳定,红色和绿色符合常规。
上样量低 — 宽范围和小分子Marker仅需3-5 μL,大分子建议5-10 μL
性能稳定 — 50℃处理20 h,无任何降解
保质期长 — 零下20℃可保存2年

 

 

蛋白Marker常见问题解答
 
 

Q1:蛋白Marker在凝胶上缺失部分条带?

 

A: 检查使用的凝胶类型和百分比。根据蛋白分子量大小不同,使用不同孔径的聚丙烯酰胺凝胶。

 

一般用于蛋白质的凝胶选用(29:1)的丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺的混合物,通常12.5%的胶可以将8-180kDa的条带有效分开,10%的胶8/15/17kDa的条带会一起压缩在前沿,8%的胶10/17/25的条带会一起压缩在前沿。

 

Q2:预染蛋白Marker启用后条带逐渐消失降解,有时只剩前沿的很深的蓝色条带。

 

A: 产生这种现象的原因是由于实验操作不当或其他,在预染蛋白Marker中引入了某种外源物质导致蛋白Marker特异降解成小片段。

 

解决方法:1.注意实验操作习惯,使用干净的一次性的取样枪头;2.多人使用时,蛋白marker启封后立即用干净的离心管和枪头分装。

 

Q3:蛋白Marker条带看起来弥散、模糊,怎么办?

 

A: 1.配试剂尽可能使用超纯水。

2.选用合适浓度的凝胶并确认凝胶在正常有效期内。凝胶放置时间过长会影响分离效果,建议使用新配制的凝胶电泳。特别注意甲叉丙烯酰胺开封后多次称取会很快失效。

3.电压过高或电泳时间过长,产热过多导致电泳缓冲液温度升高。建议参照产品使用说明书。

4.电泳缓冲液陈旧,pH值不在缓冲范围内。建议使用新鲜的电泳缓冲液,使用前预冷缓冲液。

5.存储或取用不当,引入外源污染,导致蛋白降解。建议使用干净的枪头和EP管分装Marker。

 

Q4:预染蛋白Marker可以用于非变性凝胶电泳吗?

 

A: 不建议将预染蛋白Marker用于非变性凝胶电泳。因为它们已经变性(在SDS缓冲液中)和预还原(通过专有方法),预染Marker其标示分子量不代表在非变性凝胶电泳中的样品分子量,但是可以作为一个电泳相对标尺。 

 

Q5:为什么你们的蛋白Marker跟其他品牌蛋白Marker条带指示大小不一致?换用不同凝胶,条带大小变化也不一样?有时与目的蛋白的相差也较大?

 

A: SDS-PAGE中非预染蛋白Marker受不同缓冲体系的影响小,而预染蛋白质Marker由于多肽链上连接的染料集团受不同缓冲体系的影响比较大,因此预染蛋白Marker在使用的不同缓冲体系中,需要用非预染蛋白marker进行标定。

 

  • 各个品牌预染蛋白Marker标定采用的非预染蛋白质Marker不一样。分子量相同的蛋白由于氨基酸残基序列组成不同,与SDS的结合有差异,从而显示出不同的表观分子量。

     

  • 翌圣生物标定采用广泛通用的进口品牌非预染蛋白质Marker进行标定,并且标示分子量与标定实测表观分子量非常接近(通过多次和多平行样测定)。

 

  • 各个品牌预染蛋白Marker标记采用的染料不一样,导致在不同缓冲体系中的表观分子量变化不一样,有时差距极大。比如,某进口品牌蓝色条带在Tris-Glycine与Bis-Tris胶中比较,其表观分子量变化均超过10%以上,有的条带变化甚至超过20%。

    翌圣生物预染蛋白Marker的蓝色和绿色条带表观分子量在不同的缓冲体胶中基本无变化(Tris-Glycine,Bis-Tris,Tris-acetate,Tricine)或变化极小(Hepes-Tris);红色条带跟进口品牌变化基本一致,在Bis-Tris,Tris-acetate和部分改良TrisGlycine预制胶中表观分子量降低约10%。

 

  • 目的蛋白的大小一般为理论分子量(根据组成氨基酸的数量计算出来的分子量),但由于蛋白质和多肽链的氨基酸残基组成和序列不同,结合SDS的量有差异,因此具有同样理论分子量的蛋白质其表观分子量常常与理论值有出入,有时甚至偏差很大。并且有时目的蛋白可能还存在侧链修饰,也会造成有差异。

     

    所以不能以目的蛋白的理论分子量评定蛋白Marker的准确与否。

 
 
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选择指南
 
 

产品定位

产品名称

产品编号

规格

宽范围
蛋白Marker

GoldBand Plus 3-color Regular Range Protein Marker(8-180 kDa)
三色预染蛋白质分子量标准(8-180 kDa)

20350ES72

250 μL

20350ES76

2×250 μL

20350ES90

10×250 μL

宽范围
蛋白Marker

GoldBand 3-color High Range Protein Marker(10-245 kDa)
三色预染蛋白质分子量标准(10-245 kDa)

20352ES76

2×250 μL

20352ES90

10×250 μL

大分子
蛋白Marker

GoldBand Plus 3-color High Range Protein Marker(25-300 kDa)
三色预染高分子量蛋白质分子量标准(25-300 kDa)

20347ES72

250 μL

20347ES76

2×250 μL

20347ES90

10×250 μL

小分子
蛋白Marker

GoldBand 3-color   Low Range Protein Marker(2.7-40 kDa)
三色预染低分子量蛋白质分子量标准(2.7-40 kDa)

20344ES72

250 μL

20344ES76

2×250 μL

20344ES90

10×250 μL

 

400-6111-883