Clodronate Liposomes氯磷酸盐脂质体——体内巨噬细胞清除利器
自从Nico van Rooijen教授利用巨噬细胞的内吞机制，将膜不通透性的氯磷酸（clodronate）带入细胞内，氯磷酸被释放，当达到一定的浓度时可引发巨噬细胞的凋亡，从而达到去除巨噬细胞的目的，成功开发出一款Clodronate Liposomes体内巨噬细胞清除剂。该试剂作为目前非常成熟，便捷的巨噬细胞清除工具，被广泛应用。
两亲性磷脂分子在水中可以形成同心圆形式的磷脂双分子层球体，磷脂双分子层中间通过水相分隔。溶解在水溶液中的氯磷酸盐在形成脂质体的过程中被包裹进磷脂双分子层之间的水相中（如图1）。游离的氯磷酸盐不能自由的通过脂质体的磷脂双分子层。随着脂质体被巨噬细胞吞噬，在巨噬细胞溶酶体磷酸酶的作用下，溶解在脂质体水相中的氯磷酸盐就可以被逐步释放出来，并累积在细胞内，当其达到一定浓度时，巨噬细胞将会受到不可逆转的损伤，从而进入凋亡过程（如图2）。从死亡的巨噬细胞中释放出来的氯磷酸盐在细胞外的半衰期极短（大约15 min），可以通过泌尿系统排除体外。
图1.氯磷酸-脂质体（Clodronate liposomes）复合物
图2.巨噬细胞清除原理示意图
1 mL脂质体体悬液中所含的氯磷酸大约为5 mg。所用的磷酸盐缓冲液为10 mM Na2HPO4，10 mM NaH2PO4，140 mM NaCl。
隔日尾静脉注射200 μL clodronate liposome，根据实验要求制定注射日程，通过免疫组化或流式检测巨噬细胞去除效率。
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将小鼠放在倒扣的饭盒内，从孔口拉出尾巴，小鼠的尾部有2条动脉和3条静脉，2条动脉分别在尾部的背侧面和腹侧面，3条静脉呈品字型分布，一般采用左右两侧的静脉；
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将纱布浸泡于约70℃温水中，拿出后包裹尾巴，以达到使尾部血管扩张及软化表皮角质的目的；
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行尾部静脉注射时，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出约2 cm一段，使皮肤紧张，静脉更为充盈，右手持1 mL针头注射器，使针头与静脉平行(小于30°角)，从尾巴的下1/4处进针，开始注入药物时应缓慢，仔细观察，如果无阻力，无白色皮丘出现，说明已刺入血管，可正式注入药物。
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有的实验需连日反复尾静脉注射给药，注射部位应尽可能从尾端开始，按次序向尾根部移动，更换血管位置注射给药。拔出针头后，用棉球按住注射部位轻压1-2 min，止血。
注：以上操作方法和剂量使用仅供参考，不同的实验要求需自行设计实验方案或是参考相关文献。
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靶向器官/细胞 |
实验方法 |
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脾脏/红髓区巨噬细胞 |
单次给药：200 μL/小鼠（静脉注射或腹腔注射） 长期耗竭：第一次给药剂量200 μL/小鼠，之后每隔三天给药200 μL/小鼠 |
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肝脏/Kupffer细胞 |
单次给药：200 μL/小鼠（静脉注射或腹腔注射） 长期耗竭：第一次给药剂量200 μL/小鼠，之后每隔三天给药200 μL/小鼠 |
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肺/肺泡巨噬细胞 |
静脉注射（150-200 μL）联合气管或鼻内（50 μL）给药获得最佳效果 |
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淋巴结 |
注射（100-200 μL）/小鼠，具体给药方式可参考文献 |
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脑/小胶质细胞 |
脑室脑脊液注射，10 μL/小鼠，50 μL/大鼠 |
注：本剂量仅供参考，请根据实验需求使用或参考文献。
参考案例一：
图3： 左图是正常小鼠肝脏免疫细胞中Kupffer细胞的比例，右图是注射Clodronate Liposomes 48小时后Kupffer细胞的比例，可以看到Kupffer细胞基本被清除[1]。
参考案例二：
图4： 上图是小鼠LLC细胞肺癌成瘤实验中正常肿瘤组织中的巨噬细胞（红色荧光），下图是气管灌注Clodronate Liposomes肿瘤组织中的巨噬细胞（红色荧光），可以看出肿瘤中的巨噬细胞基本被清除[2]。
Q1:收到Clodronate liposomes后该如何操作？
A:收到氯磷酸脂质体后，如果不能马上使用，需要放置在4℃冰箱。禁止冻存！使用时作为原液使用，不能进行稀释。脂质体很容易发生沉淀，建议使用之前轻轻混匀，另外4℃的氯磷酸脂质体不能马上使用，需要恢复到室温才能进行注射。
Q2:如何将脂质体从小瓶中转移出来？
A:从小瓶中转移脂质体的最佳方法是使用无菌针头注射器。这样小瓶中剩余的脂质体悬浮液就可以保持密封和清洁。您也可以使用带有无菌吸头的移液器进行转移，但最好在洁净的环境中进行，例如在BSC罩中。
Q3: Clodronate liposomes能否用于体外巨噬细胞清除？
A:产品可以用于体外巨噬细胞的清除，但是这种方法比较适合体内实验。主要是由于在体外培养过程中，从死亡细胞释放的氯磷酸或者是从脂质体中“渗漏”出来氯磷酸，会一直存在于培养基中，但是在体内，氯磷酸的半衰期很短，很快就会被肾脏清除。虽然游离的氯磷酸不会进入细胞也不会进入脂质体，但是一旦他们在培养基中积累就会慢慢地进入细胞中。
Q4:在静脉注射Clodronate liposomes后动物很快就死亡了，是什么原因？
A:一方面有可能是动物注射了不均一的脂质体悬液。建议在使用之前轻轻摇晃混匀。脂质体在体外一段时间后会发生沉降。如果在很长一段时间内需要一次注射多只动物，那么脂质体便会在注射器中发生沉淀，形成不均一悬液，这样一来，第一只注射的计量与最后一只注射的计量就会发生明显的变化。另外一方面有可能是脂质体刚从冰箱取出后，没有恢复到室温。
Q5:动物在注射Clodronate liposomes后几天就死亡了？
A：这个可能是受到细菌的污染，体内清除巨噬细胞后会增加例如病毒粒子，细菌或者酵母感染的几率。
Q6:静脉注射Clodronate liposomes后大鼠脾脏/肝脏中的ED1+细胞并没有完全消失？
A：大鼠中成熟的巨噬细胞呈现ED1和ED2双阳性，但是有一些没有吞噬功能的或者吞噬作用小的前体细胞也是ED1+，但是呈现ED2-。因此，所有ED2+的细胞都可以被完全清除，但是ED1+的细胞却只能被部分清除，清除的比率取决于前体/成熟巨噬细胞的比例。
Q7: Clodronate liposomes没有达到期望的效果？
A：氯磷酸脂质体都是大批量的生产，每批次都会对氯磷酸的浓度以及一些可能的污染物进行检测，确保无误后才会销售给客户。另外，脂质体容易收到极端温度的影响。正确的运输和储存方式是4~8℃，悬液既不能被冻存，也不能被加热超过30℃。自收到货物起，需要在3个月内使用完，不然有可能会影响使用的效果。
Q8:在静脉注射时，能不能增加注射的体积？
A：静脉注射时需要依据动物的体重，不能超过0.1 mL/10 mg，但是进行腹腔注射可以适当的增加注射的体积。皮下注射需要根据注射位点的容量进行决定。
Q9:使用脂质体应注意的一些事项？
A：通过具有饱和烃链的脂质制备而来的脂质体实际上非常坚固，但仍需要注意以下一些事项。
①不要与有机溶剂混合，如氯仿、甲醇、乙醇、DMSO、乙醚等。
②不要添加表面活性剂，除非您必须要这样做以裂解脂质体。
③不要加热、接近或高于脂质主相转变温度，除非进行药物加载，这需要在相变温度以上进行孵育。
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产品名称 |
货号 |
规格 |
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Clodronate Liposomes（From Vrije Universiteit Amsterdam） |
40337ES05/10 |
2 mL/10 mL |
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40338ES05/10 |
2 mL/10 mL |
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【注】40338体内巨噬细胞清除剂空白脂质体对照是相对于40337体内巨噬细胞清除剂而言的，仅在制备的过程中没有添加氯磷酸的成分，是实验过程中最好的阴性对照。
[1] Guan Z, Ding Y, Liu Y, Zhang Y, Zhao J, Li C, Li Z, Meng S. Extracellular gp96 is a crucial mediator for driving immune hyperactivation and liver damage. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12596. doi: 10.1038/s41598-020-69517-7. PMID: 32724151; PMCID: PMC7387550.
[2] Li R, Yang L, Jiang N, Wang F, Zhang P, Zhou R, Zhang J. Activated macrophages are crucial during acute PM2.5 exposure-induced angiogenesis in lung cancer. Oncol Lett. 2020 Jan;19(1):725-734. doi: 10.3892/ol.2019.11133. Epub 2019 Nov 21. PMID: 31897188; PMCID: PMC6924157.
