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末端修饰T4 PNK，NGS建库必备酶！

下一代测序技术(Next-generation Sequencing, NGS)由于可以同时测定几十万乃至数百万条核酸分子序列的显著优势，在分子生物学领域发挥着举足轻重的作用，越来越多的被应用到生物医学的研究领域中。T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK)作为NGS文库构建的关键酶之一，发挥了至关重要的作用，接下来小翌将围绕T4 PNK的作用方式、应用场景等方面进行介绍。

 

图1. 二代测序在临床医学中应用[1]
 

T4 PNK是什么

T4 PNK是一种多聚核苷酸5'羟基激酶，同时具有激酶活性和磷酸酯酶活性，一般主要用来催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸的5'羟基转移，即5'末端磷酸化。
图2. T4 PNK作用方式
 

T4 PNK应用于DNA建库

T4 PNK广泛应用于NGS文库构建中，这里针对性的对如何在DNA建库应用进行介绍。文库构建实质上是将片段化后的DNA两端加上通用接头序列，通过PCR扩增获取足够多能够上机测序的文库核酸分子。在DNA文库构建过程中，TA克隆连接接头建库是目前商业技术中最常用的技术手段，主要建库流程如下：
图3. DNA建库流程
DNA片段化：目前市场中测序仪的测序长度受限，因此需要使用机械/酶切打断的方法将大片段基因组DNA进行片段化。

 

末修加A：打断后的DNA会产生黏性末端以及平末端，T4 DNA聚合酶可将黏性末端转为需要的平末端，T4 PNK可磷酸化DNA的5'末端，为下一步连接接头做准备。

 

接头连接：T4 DNA连接酶可将带有“T”黏性末端的接头和带“A”黏性末端的DNA片段连接起来形成一个完整的双链。

 

PCR富集：通过PCR反应获取到足够多带完整接头的DNA序列，上机完成对样本核酸序列的测序。

 

此外，T4 PNK还可应用于RNA建库、探针合成等技术当中，其作用原理类似，都是利用其5'羟基激酶活性，这里就不展开介绍了。

 

翌圣致力于NGS酶原料的开发，该T4 PNK具有纯度高、核酸酶残留极低的特点，产品在生产过程中均经过严格质检，确保能在文库构建中发挥优异的性能。
 

性能展示

高纯度

图4. SDS-PAGE跑胶结果：该图为T4 PNK的纯度检测结果，其纯度＞95%。

无切口酶残留

 

图5. 切口酶残留结果：跑胶结果显示三批次T4 PNK与阴性对照（C）一致，显示无切口酶残留。

无核酸外切酶残留

图6. 核酸外切酶残留结果：跑胶结果显示三批次T4 PNK与阴性对照（C）一致，显示无核酸外切酶残留。

 

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产品定位

产品名称

产品货号

高效率T4 PNK

T4 Polynucleotide kinase(10 U/μL)

T4多聚核苷酸激酶(10 U/μL)

12902ES

高浓度高效率T4 PNK

T4多聚核苷酸激酶

T4 Polynucleotide kinase (25 U/μL)

14501ES

超低背景菌残留

T4 DNA聚合酶

UCF.ME® T4 DNA Polymerase (3 U/μL)

T4 DNA聚合酶(3 U/μL)

14457ES

高效率连接酶

Hieff® Quick T4 DNA Ligase

10301ES

DNA纯化/分选磁珠

Hieff NGS® DNA Selection Beads

12601ES

文库定量试剂盒

dsDNA HS Assay Kit

12640ES

DNA建库试剂盒

Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit

全能型DNA建库试剂盒

12197ES

Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit

for Illumina®

12205ES

RNA建库试剂盒

Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit 双模

式RNA建库试剂盒(兼容Illumina和MGI)

12308ES

Hieff NGS®UltimaDual-mode mRNA Library Prep Kit 兼

容Illumina和MGI双平台以及双模式mRNA 建库试剂盒

12309ES
 

参考文献

1. Consortium OPATHY, Gabaldón T. Recent trends in molecular diagnostics of yeast infections: from PCR to NGS. FEMS Microbiol Rev. 2019 Sep 1;43(5):517-547.
2. Wang LK, Lima CD, Shuman S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO J. 2002 Jul 15;21(14):3873-80.
3. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 2014 Feb 1;56(2):61-4, 66, 68, passim.

400-6111-883