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核酸质谱技术那么火，你竟然还不知道？

近年来，随着基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）被发现，核酸质谱技术慢慢走入大众的视野。核酸质谱是基于MALDI-TOF-MS发展起来的一种多重PCR分析检测系统，该技术可实现单个样本同时进行几十甚至几百种靶标检测，每日处理的样本数可达1000例以上，且结果分析简单，无需专业人士进行报告解读。

 

核酸质谱技术的出现可弥补荧光定量PCR通量低和高通量测序耗时长、报告解读复杂的不足，已经成为研究单核苷酸多态性(SNP)、基因插入/删除、基因选择性剪接、基因拷贝数变化、基因表达、基因组DNA甲基化、tRNA和rRNA的转录后修饰等课题的有效检测手段。

 

表1.不同分子诊断技术优劣势对比

 

MALDI-TOF-MS基本原理

MALDI-TOF-MS基本检测原理如下：样品与芯片基质混合结晶后，在激光的照射下基质迅速蒸发，导致样品被释放出来，同时基质将吸收到的激光能量传递至样品并使其发生电离，产生的离子在电场作用下加速通过飞行管道，其通过飞行管道的时间受离子的质量和所带电荷影响，因此，可根据它们到达检测器飞行时间实现对样品中不同物质的区分。MALDI电离技术灵敏度极高，仅需pmol～fmol级别的微量样本即可进行检测。
图1.MALDI-TOF-MS原理[1]

 

核酸质谱技术临床应用

国内已有不少厂家通过自主研发或合作方式布局核酸质谱仪，目前已有近5家厂商拥有国内核酸质谱仪注册证，而核酸质谱配套试剂大部分尚处于开发阶段。

 

表2.核酸质谱技术临床应用场景

 

核酸质谱技术在基因检测中的应用原理

基因分型检测原理及过程

图2.基因分型检测原理及过程[2]
 

 

1.聚合酶链式反应（PCR）：根据待检测位点设计上下游引物各一条，以样本DNA为模板，进行PCR，获得包含目标位点的PCR产物片断。
2.虾碱式磷酸酶（SAP）处理：加入SAP(10322ES)对PCR产物进行去磷酸化反应，消除反应体系中剩余的dNTP。
3.单碱基延伸反应：加入一条单碱基延伸引物以及ddNTP，进行单碱基延伸反应。
4.树脂纯化：加入脱盐树脂对延伸产物进行脱盐纯化，避免盐离子峰在质谱中对结果造成干扰。
5.样品与基质结合：将样本点到带有基质的芯片上，进行质谱检测，不同基因片段最终形成不同的检测峰图谱。

 

DNA甲基化分析技术检测原理及过程

图3.DNA甲基化分析技术检测原理及过程[3]

 

1.亚硫酸氢盐处理：通过亚硫酸氢盐反应将序列中未甲基化的C转化为U，而甲基化的C保持不变，处理后的核酸片段中甲基化和未甲基化的碱基分子量便出现差异。
2.PCR反应：使用5’末端带有T7启动子序列的引物对目标CpG岛区域进行PCR扩增，形成带有T7启动子的扩增产物。
3.SAP处理：加入SAP对PCR产物进行去磷酸化反应，消除反应体系中剩余的dNTP。
4.体外转录：利用T7 RNA聚合酶(10624ES)对扩增产物进行体外转录，形成与反向序列一致的RNA转录产物，即未甲基化的C最终变为A，而甲基化的C最终变为G。
5.特异性核糖核酸内切酶处理：在转录产物中加入特异性核糖核酸内切酶（10405ES），如利用RNase A特异性识别并切割RNA中U碱基3’端的特性，将产物切割成各种带有CpG位点的小片段RNA。
6.样品与基质结合：将样本点到带有基质的芯片上，进行质谱检测，不同基因片段最终形成不同的检测峰图谱。

 

翌圣生物利用其双向分子酶理性设计与定向进化平台对分子酶进行升级改造，可提供核酸质谱技术所需全套高品质原料，为核酸质谱配套试剂的上市保驾护航。

 

YEASEN核酸质谱试剂相关原料

产品货号

产品名称

产品定位

18301ES

Monkeypox Virus Real Time qPCR Kit

核酸提取

18506ES

磁珠法32孔血液DNA提取试剂盒（预装版）

PCR扩增

10726ES

Hieff UNICON® Hotstart E-Taq DNA Polymerase, 5 U/μL

10717ES

Hieff Unicon® Hotstart Direct Taq DNA Polymerase,5 U/μL

10723ES

Hieff Unicon® Hotstart J-Taq DNA polymerase, 5 U/μL 热启动抗体修饰突变体Taq酶

10125ES

dNTP Mix(25 mM each)

10322ES

Shrimp Alkaline Phosphatase(SAP)(1U/μl) 虾碱性磷酸酶

SAP处理，去除多余dNTP

10624ES

T7 RNA Polymerase GMP-grade (50 U/μL)

体外转录

10133ES

NTP Set Solution (ATP, CTP, UTP, GTP, 100 mM each)

10405ES

RNase A(10 mg/mL) 核糖核酸酶A(10 mg/mL)

特异性核糖核酸内切酶
 

参考文献

1. Singhal N, Kumar M, Kanaujia PK, Virdi JS. MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Front Microbiol. 2015;6:791. DOI: 10.3389/fmicb.2015.00791
2. Justine A, Benjamin O. The MassARRAY® System for Targeted SNP Genotyping. Genotyping. pp 77–94. DOI: 10.1007/978-1-4939-6442-0_5
3. Gao X, Tan B, Richard J, et al. MALDI Mass Spectrometry for Nucleic Acid Analysis. Applications of MALDI-TOF Spectroscopy. pp 55–77. DOI: 10.1007/128_2012_366

400-6111-883