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Ceturegel™基质胶应用——小鼠小肠类器官构建

类器官（organoids）是指利用干细胞、祖细胞、肿瘤细胞等在体外培养出的3D细胞培养物并具有一定的空间结构组织类似物。2021年，类器官技术被列为“十四五”国家重点研发专项[1]，作为疾病模型，相比于传统2D疾病模型，类器官在阐明疾病的发展、稳态性和发病机理等与体内环境更加接近，在多领域将发挥重要，诸如细胞治疗、药物研发、基因工程、免疫研究、组织再生等领域。
图：类器官的应用方向[2]

 

类器官主要由成体干细胞或肿瘤样本在适宜的培养条件下构建。类器官的整体培养体系包括组织消化、清洗、处理、培养基配置、基质胶与细胞的混合、培养、观察等步骤。其中，细胞悬液与细胞外基质（基质胶）混合是关键的步骤之一，为类器官提供3D生长载体。

 

基质胶主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等组成，还包含生长因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、组织纤溶酶原激活物和EHS肿瘤自身含有的其他生长因子。为组织和细胞提供支撑、抗拉强度和支架支撑等。翌圣生物开发生产的CeturegelTM基质胶不含LDEV（乳酸脱氢酶增高病毒），超低内毒素含量，并全部经过支原体检测保证无支原体污染，包括基本浓度、高浓度、低生长因子等不同类型基质胶。 
Ceturegel™基质胶

 

应用方向

 

产品特点

 

小鼠小肠类器官构建

实验步骤

1. 样本制备：小鼠断颈处死，表面喷洒酒精杀菌。在无菌环境下截取出近胃端处3~15cm肠组织，用镊子小心去除肠道外部的肠系膜、脂肪，放入4℃预冷的含1%双抗的DPBS溶液中。

 

2. 样本清洗：使用注射器冲洗肠道2-3次，用手术剪将肠管小心剪开，肠腔面朝上，手使用手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后（呈现组织透明），将肠组织置于新的含 DPBS 的培养皿中清洗2~3次。

 

3. 样本初处理：将清洗后的小肠组织剪碎至2mm宽大小块状体，顺势转移至新的50ml离心管中，用DPBS轻柔清洗3-5次，除去肠绒毛细胞和漂浮脂肪组织。

 

4. 样本消化：在清洗好的小肠碎片组织加入10-15ml含有3-5mM EDTA 的预冷 DPBS 中消化，4℃孵育 30min左右，期间每10min轻摇一次离心管。

 

5. 消化完成后，弃去EDTA消化液上清，用新的DPBS缓冲液将组织轻柔漂洗2~3次以去除剩余的EDTA。

 

6. 在小肠组织碎片中加入10~15ml预冷的含0.1%BSA的DPBS，反复吹打、重悬组织碎片，使隐窝与基底层分离，然后取少许悬液镜检，当看有大量隐窝样结构后，停止吹打，并对吹打后的组织悬液使用70μm滤网过滤并收集穿过滤网的组织悬液。

 

7. 重复步骤5-6两次，1500rpm、4℃离心 3min。

 

8. 混合物形成：用Ceturegel™基质胶重悬隐窝组织沉淀，每10μL基质胶悬液包含200~600个隐窝，重悬后混合液置于冰上，尽快操作以避免基质胶形成凝胶。
注意： 基质胶稀释比例≥50%以保证培养过程中Ceturegel™基质胶结构的稳定性。

 

9. 将混合悬液种植于24孔板底部正中央，每孔30~50μL左右，避免悬液接触孔板侧壁。 
 
10. 将种植后的培养板至于37℃二氧化碳恒温培养箱中，孵育30min左右待基质胶凝固。

 

11. 待Ceturegel™基质胶完全凝固后，沿壁缓慢加入已配制好的肠类器官培养基，每孔 800μL/孔。

 

12. 将 24 孔板置于37℃二氧化碳培养箱中培养。每3天更换一次新鲜培养基并监测类器官生长状态，一般小鼠小肠类器官在5~7天内形成。
 

实验结果

Day0  

  Day3

Day5

Day7

图：小鼠小肠类器官体外培养结果图

 

FAQ

1.消化组织选择什么消化液，消化时长是多少？
组织的消化液可以选用EDTA或胶原酶，如果消化空腔性器官使用EDTA适合，如小肠和胃；胶原酶有不同类型，消化的组织类型比较广泛，可以搭配DNA酶一起。不同组织消化时间差异比较大，从十几分钟到数时小时。

 

2.基质胶的操作要注意哪些事项？
所有操作需在无菌环境下进行，应使用预冷的移液器以保证基质胶呈匀浆状。

 

3.基质胶的如何分装冻存使用？
可将冻融后的Ceturegel™基质胶分装在多个小管，所有分装均需用预冷的冻存管，迅速冷冻并保存，避免多次

 

4.不同孔板培养类器官培养所需的基质胶和培养基体积?
培养类器官常用的是24孔板培养，按50μl/孔形成胶滴，再加入500~800μl培养基覆盖胶滴；96孔板按10μl/孔形成胶滴，再加入200μl培养基覆盖胶滴；6孔板每孔可以种植多个50μl胶滴，加入2~3ml培养基覆盖胶滴。

 

相关产品

类型

货号

产品名称

应用方向

即用型

3-6 mg/ml

40182

Ceturegel®  Matrix Ready-to-use，LDEV-Free基质胶

适应于细胞培养、贴壁、侵袭和迁移实验以及细胞分化等研究

 

基本浓度

8-12 mg/ml

40183

Ceturegel® Matrix LDEV-Free基质胶

适应于2D和3D培养、侵袭和迁移实验，也可以用于体内成瘤实验

40184

Ceturegel® Matrix Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶

主要应用于需要颜色检测如荧光检测实验等

 

高浓度

≥18mg/ml

40187

Ceturegel® Matrix High Concentration，LDEV-Free 基质胶

 

主要应用于如血管生成、凝胶栓塞和体内成瘤实验（对于血管生成建议基质胶终浓度要≥10mg/ml）

40189

Ceturegel® Matrix High Concentration，GFR，LDEV-Free 基质胶

40188

Ceturegel® Matrix High Concentration，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶

 

 

低生长因子

40185

Ceturegel® Matrix GFR，LDEV-Free 基质胶

 

主要是排除生长因子对实验的干扰。应用于与生长因子、信号通路等相关研究。无酚红的也用来做类器官培养

40186

Ceturegel® Matrix GFR，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶

干细胞用

40190

Ceturegel® Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基质胶

主要用于如hESC，iPSC等干细胞培养

类器官用

40191

Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基质胶

类器官培养专用基质胶

 

鼠尾胶原

40125

Collagen, Type I , from rat tail 鼠尾胶原蛋白I（大鼠源）

侵袭和迁移。培养或分化研究

40136

Cebrary® Collagen, Type I , from mouse tail 鼠尾胶原蛋白I型（小鼠源）

侵袭和迁移。培养或分化研究

 

[1]  http://www.chinazx.org.cn/i.php?id=3398
[2] Corrò, Claudia; Novellasdemunt, Laura; Li, Vivian S.W. (2020). A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology, ajpcell.00120.2020.

400-6111-883