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翌圣GMP级别IIs型内切酶——mRNA药物疫苗研发生产首选

限制性内切酶被称为DNA研究中的“手术刀”，自发现以来推动了许多基础生物学研究和商业化应用的发展。在往期的文章中已经对限制性内切酶做了详细介绍： 干货|限制性内切酶知多少？今天为大家介绍IIs型内切酶。

特殊的IIs型内切酶

II型限制性内切酶是目前基因工程中最常见的切割酶，特异性识别4-8个核苷酸序列（具有回文结构），切割位点位于识别位点内或附近，酶切后生成粘性末端或者平末端。II型内切酶可细分为11个类型：A, B, C, E, F, G, H, M, P, S和T。

 

IIs型内切酶属于II型内切酶中较为特殊的一类，突出特点在于：

 

1. 识别位点为不对称序列，在识别位点下游切割DNA。
2. 酶切位点与识别位点之间的距离是酶依赖的，酶与识别位点结合后，即可切割适当距离DNA序列。
3. 对切割位点序列无要求，可以是任意序列。
4. 特定IIs型内切酶切割两个不同DNA片段所形成的的黏性末端不配对。

 

图1. Type II与Type IIs型内切酶识别位点与切割序列比较

 

IIs型内切酶基于以上特性，成为了mRNA生产中质粒线性化的首选酶，同时也开创了Golden Gate组装技术。

 

IIs型内切酶用于质粒线性化

mRNA药物生产过程中，常使用质粒作为体外转录步骤中的DNA模板，由于环状质粒作为转录模板会产生长度不同的RNA产物，所以环状质粒需要酶切线性化，转录形成特定长度的RNA产物。
 
图2. mRNA疫苗的示意图及其抗原表达的机制[1]
 

IIs型内切酶的切割位点位于识别位点之外，线性化后的DNA模板上不会留下“疤痕”， 体外转录过程中也不会添加不需要的核苷酸。poly（A）尾巴（具有调节mRNA翻译效率功能）可以通过质粒DNA模板限制切割和转录获得，在mRNA产品中加入特定数目的poly（A）。因此IIs型内切酶成为mRNA体外合成中质粒线性化的首选酶。

 

IIs型内切酶用于Golden Gate组装

IIs型内切酶识别位点是一个非回文对称的序列，切割位点位于识别位点的外侧，因此，当被IIs型内切酶酶切后的两个片段相连时，原来的识别位点不存在，在后续的酶切连接反应中不会被再次切割。Golden Gate组装就是利用IIs型内切酶的这一特性在这些酶的识别序列外侧人为地设计切割位点不同的序列，然后利用同一内切酶产生不同的黏性末端，从而实现酶切与连接在同一管内，一次性无缝组装多个片段。
图3. Golden Gate assembly流程图[2]
 

Golden Gate assembly技术流程：

 

1. 通过PCR扩增或寡核苷酸合成等技术向目的片段中引入IIs型内切酶（如BsaI、BsmBI等）的识别序列。

2. IIs内切酶识别目的片段和载体上的酶切位点，并在识别位点之外进行酶切。

3. 在连接酶的作用下将目的片段和载体进行无缝连接，实现单片段或多片段重组。

翌圣IIs限制性内切酶-BspQI

BspQI属于Type IIs型内切酶中的一种，可用于mRNA体外合成中质粒线性化，也可用于Golden Gate组装。

 

产品优势

1. GMP级别：无抗无动物源发酵、纯化工艺。
2. 高酶切效率。
图4. BspQI酶切效果图：以λDNA为模板，分别投入翌圣及竞品N*的BspQI 0.125 U、0.5 U、2 U、4 U，结果显示翌圣不同投入量的BspQI（Cat#10664ES）均可对λDNA进行有效切割。

 

3. 严格质控：
核酸外切酶、切口酶、RNase酶、非特异性核酸酶、支原体检、宿主蛋白残、大肠基因组残留均严格质控。

 

图5. BspQI切口酶残留检测：相同反应体系中分别加入10U 翌圣及竞品N*的BspQI和0.5 μg质粒DNA，50℃孵育4小时，琼脂糖凝胶电泳检测翌圣BspQI（Cat#10664ES）切口酶残留低于竞品N*。
 
图6. BspQI非特异性核酸酶残留检测：相同反应体系中分别加入10U翌圣及竞品N*的BspQI和1 μg λDNA, 50℃孵育1、16小时，琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示翌圣BspQI（Cat#10664ES）无非特异性核酸酶残留。
 

 

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产品定位

产品名称

产品货号

GMP级别Ⅱs型

BspQI GMP-grade (10 U/μL)

10664ES

常规系列Ⅱs型

BspQI限制性内切酶 (10 U/μL)

15202ES

BsmBI（10 U/μL）

15203ES

BsaI（20 U/μL）

15204ES

5-15min快速酶切系列

FuniVutTM系列

15001ES-15052ES

 

参考文献
[1] Maruggi G, Zhang C, Li J, Ulmer JB, Yu D. mRNA as a Transformative Technology for Vaccine Development to Control Infectious Diseases. Mol Ther. 2019;27(4):757-772
[2] 史晏榕, 孙宇辉. DNA 克隆和组装技术研究进展[J]. 微生物学通报, 2015, 42(11): 2229-2237

400-6111-883