LAMP技术之引物设计与关键酶原料选择
日本学者Notomi等在2000年开发的环介导核酸等温扩增技术LAMP，可在恒温条件下实现扩增特异性核酸序列的目的。和常规PCR相比，LAMP技术因无需专用的仪器设备、扩增时间短、灵敏度高等特点，在现场检测和即时诊断中显示了良好的应用前景。
LAMP技术实验虽然非常简单，但其引物设计较为复杂、严苛。正确的引物设计与高质量关键酶原料的选择是成功进行LAMP扩增的必要条件。
LAMP技术检测引物类别
LAMP技术主要是针对靶基因的6个不同的区域，包括3'端F3c、F2c和F1c区域以及5'端B1、B2和B3区域设计4~6条引物。
1.上游内部引物-FIP
FIP引物(Forward Inner Primer)由F2区和F1c区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。
2.上游外部引物-F3
F3引物(Forward Outer Primer)由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。
3.下游外部引物-BIP
BIP引物（Backward Inner Primer）由B1c和B2区域组成，B2区与靶基因3'端的B2c区域互补，B1c域与靶基因5'端的Blc区域序列相同。
4.下游外部引物-B3
B3引物(Backward Outer Primer )由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
5.环状引物Loop F和Loop B
F2c的3’末端和F1c的5’末端可设计上游环状引物Loop F，B1的3’末端和B2的5’末端之间可设计下游环状引物Loop B，以提高反应速度及检出率。
注：LAMP技术中环状引物Loop F和Loop B为非必需引物，对于灵敏度要求不高的LAMP反应可以不用Loop F和Loop B引物。
图1. LAMP技术检测引物类别示意图
图片来源：Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): The Better Sibling of PCR? Cells. 2021 Jul 29;10(8):1931. doi: 10.3390/cells10081931. PMID: 34440699; PMCID: PMC8393631.
LAMP技术引物设计原则
推荐使用日本荣研在线免费LAMP引物设计软件PrimerExplorer v5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）设计引物，上传的DNA特异性序列＜2000 bp，靶标序列长度≤280 bp，引物设计需考虑Tm值、间距、GC含量、末端稳定性和二级结构等问题。
1.引物Tm值范围区间
F1c/B1c为64~66°C，F2/B2、F3/B3为59~61°C，LoopF/LoopB的Tm值为64~66°C。
2.引物间距
F2的5端与B2的5端距离为120-160 bp，F2的5端与F1c的5端相距40-60 bp, F2的5端到F3的3端为0-60 bp。
3.引物GC含量
一般GC含量为40-65%，当GC含量为50-66%时效果更佳。
4.引物末端稳定性
F2/B2、F3/B3、与LoopF/LoopB的3端和F1c/B1c的5端的 ΔG≤–4 kcal/mol。
5.二级结构
避免引物中单碱基或双碱基重复3次以上（如ACCC，ATATAT），避免形成引物二聚体或发夹结构，造成非特异性扩增。
在LAMP技术中，正确的引物设计是成功进行扩增的前提条件，高质量关键酶原料的选择则是成功进行LAMP扩增的必要条件。该技术需利用链置换型Bst DNA聚合酶在60~65℃恒温条件下进行扩增反应，在15-60 min内实现目标序列109-1010倍的扩增。
LAMP技术关键酶原料的选择
-链置换Bst DNA聚合酶
翌圣生物Hieff® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）是将缺少5′→3′外切核酸酶结构域的Thermophilic Geobacillus sp DNA 聚合酶基因在E.coli中表达纯化而得。该酶链置换能力强，具备高灵敏度、高扩增效率、高dUTP耐受性的优势，可广泛应用于基于等温扩增技术的病原体即时检测。
1. 灵敏度低至50 copies/T，反应时间＜15 min（荧光定量RT-LAMP法）
图2. 用翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase进行RT-LAMP反应，扩增新 冠病毒。25 μL反应体系中，50 copies/T的检出率达100%，反应时间＜15 min。
2. 高dUTP耐受性
使用翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase进行RT-LAMP反应，扩增新 冠病毒(20 copies/T)。在推荐反应方案中引入dUTP/UDG酶防污染系统，使用dUTP替换dTTP。对比全U（35 mM）替换（红色扩增曲线）与T：U = 1：1（蓝色扩增曲线）的扩增结果发现，在反应体系中添加dUTP对Hieff® Bst Plus DNA Polymerase的灵敏度及扩增效率无影响，该酶具有较高的dUTP耐受性。
图3. 翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase高dUTP耐受性验证结果。
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