动物植物多样本直接PCR（直扩PCR）
——More Genotyping, Less Time and Fewer Reagents
PCR-based Genotyping等实验，常需纯化样本基因组。当待测样本较多时，纯化基因组的过程费时、操作重复，并且实验成本高。翌圣生物通过改造Taq DNA聚合酶，优化PCR反应体系开发出无需基因组纯化的Direct PCR Kit系列产品。
Clever PCR：Direct PCR
翌圣Direct PCR Kit是直接从样本开始，以未经基因组纯化的微量原始样本（图1-A）或其裂解产物（图1-B）作为模板，进行PCR-based Genotyping（见图1）。与常规PCR-based Genotyping相比，Direct PCR Kit样本用量少，操作简单，实验成本低，可高通量化样本检测。
图1. 直扩PCR扩增流程图
A. 直接法：取少量样本直接加入到PCR Master Mix中，进行PCR鉴定。
B. 裂解法：样本取样后，加入裂解液中，裂解释放基因组，取少量裂解上清液加入到PCR Master Mix中，进行PCR鉴定。
技术优势
★ 直接：无需进行费时而昂贵的DNA纯化
★ 快速：10 min完成模板制备，最少30 min完成PCR反应
★ 简便：样品无需剪碎或研磨即可完成裂解，PCR Mix为预混液形式，减少加样步骤
★ 节省：材料用量少
★ 高通量：可在96孔板中完成裂解反应
★ 耐抑制：耐受多种动物、植物样本
Direct PCR Kit实验过程
本系列产品运用独特的蛋白酶裂解体系，裂解样品，裂解液可直接作为模板，搭配试剂盒中的PCR Master Mix进行基因扩增。
图2.动物、小鼠组织直接PCR实验过程
图3.植物组织直接PCR实验过程
直扩PCR产品选购表
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产品系列 |
小鼠直扩二代 |
小鼠直扩一代 |
血液直扩 |
植物直扩 |
动物直扩 |
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产品货号 |
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产品规格 |
20 T/50 T/200 T/500 T |
50 T/200 T |
20 T/50 T/200 T/500 T |
50 T/200 T |
50 T/200 T |
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特点 |
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扩增长度 |
≤5 kb |
≤1 kb |
≤8 kb |
≤1 kb |
≤1 kb |
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延伸时间(/kb) |
3-20 s |
30 s |
2 kb以内3-5 s |
60 s |
20 s |
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适用生物 |
小鼠、大鼠 |
小鼠、大鼠 |
人、小鼠、山羊、鸡、猪等 |
水稻、玉米、烟草、油菜、小麦、大豆等 |
小鼠、兔子、鸟类、淡水鱼、果蝇、线虫、狗 |
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适用组织/材料类型 |
鼠尾、鼠耳、脚趾（带肌肉）和其他脏器 |
鼠尾、鼠耳、脚趾（带肌肉）和其他脏器 |
含EDTA、肝素、柠檬酸盐等常规抗凝剂的新鲜血液、冷藏（冻）血液及Whatman903®和FTA®商用干血渍 |
嫩叶、老叶、幼苗、嫩茎 |
脑、心脏、肝脏、胰脏、肾脏、脾脏、睾丸、肌肉、羽毛末端 |
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样品使用量 |
组织：5 mg |
组织：5-10 mg |
全血：0.5%-20% |
叶片：1-10 mm |
5-10 mg |
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基因组释放时间 |
5-10 min |
15 min |
0-3 min |
0-10 min |
5-30 min |
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产物末端结构 |
平末端 |
平末端 |
平末端 |
平末端 |
平末端 |
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退火温度 |
Tm-(2~5)℃ |
Tm-(2~5)℃ |
Tm-(1~2)℃ |
Tm-(2~5)℃ |
Tm-(2~5)℃ |
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GC兼容范围 |
29-70% |
30-70% |
30-75% |
40-65% |
30-70% |
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5‘-3’外切酶活性 |
O |
O |
O |
O |
O |
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应用 |
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基因鉴定 |
O |
O |
O |
O |
O |
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多重PCR |
O(5重) |
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O(3-4重) |
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样本直扩 |
O |
O |
O |
O |
O |
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其他特点 |
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电泳指示剂 |
无色 |
蓝色 |
无色 |
蓝色 |
蓝色 |
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热启动 |
O |
O |
O |
O |
O |
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预混液/试剂盒 |
Kit（含Mix） |
Kit（含Mix） |
Kit（含Mix+buffer） |
Kit（含Mix） |
Kit（含Mix） |
产品优势
改造的Taq DNA Polymerase是Direct PCR的保证：超强的抑制物耐受性
对于非纯化样本作为模板时，会引入很多对PCR反应有抑制的成分。以普通的PCR反应体系和Taq DNA聚合酶较难得到理想的结果，甚至无法进行PCR扩增。本系列试剂盒中PCR Mix为配方优化预混液，采用改造的Taq DNA Polymerase，增加与模板DNA结合能力，对于常见PCR抑制剂具有更高的耐受性，因此具有更广泛的模板适应性。
图4.直接PCR Kit中的PCR Mix具有更高的杂质耐受度。相同模板量，用不同的PCR Mix进行PCR，同时在体系中加入不同浓度的各种PCR反应抑制物。比较不同条件下的PCR产物量。
翌圣生物针对不同样本，开发出一系列产品
啮齿类专用型：Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus（10189ES）
适用样本：小鼠组织（如鼠尾、鼠耳、鼠趾等）
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扩增效率高（长度、速度、GC兼容性）
图5. Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus对不同组织裂解产物进行扩增。裂解条件：70℃裂解10min，95℃失活5min。目的片段分别为1kb，2kb，3kb，6kb，延伸时间分别设置3，5，10，20 s/kb，Marker为10510ES60 (Yeasen)。
-
基因分型检测对比
图6. 取不同组织裂解产物进行多重PCR扩增，五对引物片段大小分别为200bp、400bp、600bp、800bp、1000bp，Marker：Yeasen 10501ES60。
结论：Mouse Tissue Direct PCR Kit可对不同组织裂解产物进行5重基因分型检测，优于竞品性能。
-
广泛的模板兼容性（10189ES）
图6. 使用Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus直接裂解（70℃裂解10 min）扩增人293细胞、唾液、头皮组织，均有明显的目的条带，Marker: 10510ES60 (Yeasen).
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扩增速度及产量对比（10189ES）
1. 质粒 10189 1 kb 11. 质粒 10189 2 kb
2. T品牌 鼠耳 1 kb 12. T品牌鼠尾 2 kb
3. T品牌鼠尾 1 kb 13. T品牌鼠耳 2 kb
4. T品牌鼠趾 1 kb 14. T品牌鼠趾 2 kb
5-6. 10189 鼠耳 1 kb 15-16. 10189 鼠耳 2 kb
7-8. 10189 鼠尾 1 kb 17-18. 10189 鼠尾 2 kb
9-10. 10189 鼠趾 1 kb 19-20. 10189 鼠趾 2 kb
图7. 使用Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus和T品牌产品裂解不同组织扩增不同大小的目的片段，10189ES延伸速率为5 sec/kb，T品牌延伸速率1min/kb。（70℃裂解10 min）
结论：Mouse Tissue Direct PCR Kit Plus对不同组织裂解产物进行不同大小的目的片段扩增，在快速扩增的同时，均可达到产品定位的扩增效果，尤其是2 kb的扩增效果优于竞品。
多动物血液通用型：Blood Advanced Direct PCR Kit（10188ES）
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扩增长度高达8 kb
图8. 使用Blood Advanced Direct PCR Kit直接从人全血中扩增不同长度DNA片段。血样为-20℃储存的EDTA抗凝血，血液模板浓度为10%，延伸时间设置10 s/kb。M为10510ES60（Yeasen）。
-
耐受性强
图9. A. 使用Blood Advanced Direct PCR Kit直接从人EDTA抗凝全血中扩增2 kb长度、GC含量71%的DNA片段。血液模板浓度设置梯度0.5-50%，延伸时间为10 s/kb。图注B. 使用Blood Advanced Direct PCR Kit直接从小鼠EDTA抗凝全血中扩增2.2 kb长度、GC含量67%的DNA片段。血液模板浓度设置0.5-50%，延伸时间为10s/kb。M为10510ES60（Yeasen）。
植物类专用型：Plant Tissue Direct PCR Kit（10187ES）
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多类型植物样本验证
图10.不同类型植物叶片直扩结果。M：100 bp DNA ladder。C：相应植物纯化基因组DNA为模板。1-2：叶片组织裂解产物为模板。循环数：30个循环。
多动物通用型：Animal Tissue Direct PCR Kit（10184ES）
适用样本：小鼠、兔子、鸟类、淡水鱼、果蝇、金鱼、线虫、狗
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最快速：操作时间短
图11. 翌圣动物组织直接PCR试剂盒更加节省时间
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实验例：基因敲除小鼠基因型鉴定
图12. 动物组织直接PCR试剂盒检测基因敲除动物组织直扩结果。M：100bp DNA ladder。1-8：以裂解产物为模板。+：以50ng纯化基因组DNA为模板。﹣：以去离子水为模板。循环数：35个循环。单条带（580bp）：敲除动物纯合子基因组。单条带（180bp）：野生型基因组。两条带（580bp/180bp）：敲除动物杂合子基因组。
客户案例
小鼠基因型鉴定
广州某生物公司：
图13. 小鼠直扩试剂盒（10189ES）扩增鼠尾。目的基因：500 bp；裂解时间：10 min；PCR反应体系：25 μL，延伸时间：5 sec/kb。
北京某生物公司：
图14. 动物直扩试剂盒（10184ES）鉴定小鼠基因型。
水稻基因直扩
华中农业大学：
图15.植物直接PCR试剂盒（10187ES）扩增水稻相关基因。
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产品定位 |
产品名称 |
产品货号 |
规格 |
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直扩裂解液 |
小鼠组织裂解组分Mouse Tissue Lysis Component |
50T/200T |
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高质量琼脂糖 |
Agarose琼脂糖 |
100 g/500 g |
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核酸染料（紫外光） |
YeaRed Nucleic Acid Gel Stain(10,000× in Water) YeaRed核酸染料(10,000× 水溶液) |
500 μL |
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核酸染料（蓝光、紫外光） |
YeaGreen Nucleic Acid Gel Stain (10,000×in Water) |
500 μL |
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快速PCR升级，可菌P且适用复杂模板扩增 |
2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix |
1 mL/5×1 mL |
