蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是将蛋白质经电泳分离后转移到膜上，然后利用抗体进行检测的技术。完整的WB流程，如下图所示，包含样本制备、SDS-PAGE、转膜、抗体结合、蛋白检测等5个大步骤。

样品制备

1、蛋白提取

1）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1 mM。

2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。细胞充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必须分装成0.5-1X10⁶个细胞/管，然后再裂解。

组织样本：按照每20 mg组织加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5 min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

【注】：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

 

产品详情：

产品名称	产品编号	规格	目录价/元
RIPA lysis buffer (strong) RIPA裂解液（强）	20101ES60	100 mL	228
RIPA Lysis Buffer (Medium) RIPA裂解液（中）	20115ES60	100 mL	228
RIPA lysis buffer (Weak) RIPA裂解液（弱）	20114ES60	100 mL	228
Lysis Buffer for WB/IP Assays 免疫印迹及免疫沉淀用（WB/IP）裂解液	20118ES60	100 mL	228
PMSF苯甲基磺酰氟	20104ES03	1 g	113
	20104ES08	5×1 g	453

 

2、蛋白定量

1）配制BSA标准品体系

标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1XPBS进行稀释。BSA标准品体系配制可参考下表。

表1 BSA标准品体系配制（微孔板检测，线性范围20-2000 μg/mL）*

Vial	稀释液体积( μL)	2mg/mL BSA体积( μL)	BSA终浓度( μg/mL)
A	0	100	2000
B	25	75	1500
C	50	50	1000
D	125	75	750
E	150	50	500
F	350	50	250
G	375	25	125
H	395	5	25
I	400	0	0=Blank

*如用比色皿检测，每管需加100 μL标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300 μL。

2）取25 μL标准品或待测样品加入到微孔板中。

3）每孔加入200 μL BCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30 min。

4）冷却到室温，在酶标仪上的540-595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为最佳。

5）根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/mL；Y-最终的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

 

产品详情：

产品名称	产品编号	规格	目录价/元
BCA Protein Quantification Kit BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）	20201ES76	500 T	288
	20201ES86	2500 T	818
	20201ES90	5000 T	1518

 

SDS-PAGE电泳

1）剪开包装取出预制胶，撕去胶板底端蓝色胶带，缓慢地拔出梳子，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满电泳缓冲液，外槽液体加入量要高于电泳槽高度1/3。可用移液枪或其他工具吸取电泳缓冲液轻轻吹打加样孔，去除加样孔内残留的储存缓冲液和杂质。

2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。

3）按照每4 μL蛋白样品加入1 μl 5XSDS-PAGE 蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

4）100℃或沸水浴加热 3-5 min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。

5）在每个样品孔中上样10-30 μg蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，推荐150V，跑30-40 min，通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。

6）电泳结束，取出凝胶，使用起胶器或其他合适的工具插入到胶板两侧之间的空隙中，慢慢的上下撬动上、中、下三个不同的位置，然后在另一侧重复操作，直至胶板两侧完全打开。

7）胶板打开后，凝胶可能粘在胶板的任意一侧，将有凝胶一侧的胶板倾斜至水中，轻轻拨动凝胶，使凝胶自由掉落到装有水的器皿中，晃动清洗凝胶，然后取出进行后续转膜实验。

产品详情：

产品名称	产品编号	规格	目录价/元
5×SDS-PAGE Protein Loading Buffer5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液	20315ES05	2×1 mL	28
	20315ES20	20×1 mL	225
	20315ES76	500 mL	3855
Precast Protein Plus Gel, 4-20%, 10 wells, Hepes-Tris 4-20%高分辨率预制胶(Hepes-Tris)，10孔	36250ES10	1 盒（10 块）	388
Precast Protein Plus Gel, 4-20%, 15 wells, Hepes-Tris 4-20%高分辨率预制胶(Hepes-Tris)，15孔	36256ES10	1 盒（10 块）	388
GoldBand Plus 3-color Regular Range Protein Marker (8-180 kDa)三色预染蛋白质分子量标准（8-180 kDa）	20350ES72	250 μL	386
	20350ES76	2×250 μL	676
	20350ES90	10×250 μL	2766
GoldBand 3-color Regular Range Protein Marker (10-180 kDa)三色预染蛋白质分子量标准（10-180kDa）	20351ES72	250 μL	386
	20351ES76	2×250 μL	676
	20351ES90	10×250 μL	2766
GoldBand 3-color High Range Protein Marker (10-245 kDa)三色预染蛋白质分子量标准（10-245 kDa）	20352ES76	2×250 μL	786
	20352ES90	10×250 μL	2996

 

转膜与封闭

1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5 min。（如果检测小分子蛋白质，可省略该步骤，因小分子蛋白容易扩散）。

2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10 min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2 min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。（膜的选择：0.45 μm孔径，用于一般蛋白；0.22 μm孔径，用于分子量小于20 kD蛋白）

3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。

4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液（300 mA, 60 min），或使用快速转膜液（400 mA, 15-35 min）

5）转膜结束后，切断电源，取出膜。

6）将膜浸没在5 mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10 min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。注：如果没有出现染色条带，则表示转膜失败，可能需要重新转膜或重新上样电泳。

7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5 min。

8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5 min；倒去洗脱液，再重复一次。

9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5 min。

10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时或使用快速封闭液（10 min）。

11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

   

产品详情：

产品名称	产品编号	规格	目录价/元
0.45 μm PVDF膜（进口分装，8.5×13.2 cm）	36124ES10	10张/包	565
10×Fast Transfer buffer  10×快速转膜液	36123ES76	500 mL	165
Fast Blocking Western 快速封闭液	36122ES60	100 mL	135
	36122ES76	500 mL	495

                   

抗体孵育

1）将膜和一抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10 mL一抗稀释缓冲液中在4ºC下孵育过夜并不时轻轻晃动。

2）用5 mL TBST洗涤三次，每次15 min以去除残留的一抗。

3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10 mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。

4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。

产品详情：

产品名称	产品编号	规格	目录价/元
β-actin, Mouse mAb小鼠抗β-actin单克隆抗体	30101ES50	50 µL	686
	30101ES60	100 µL	1126
GAPDH (Clone1A6) Mouse mAb 小鼠抗GAPDH 单克隆抗体	30201ES20	20 µL	426
	30201ES60	100 µL	1356
Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG(H+L) 过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)	33201ES60	100 µL	195
Peroxidase-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)  过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）	33101ES60	100 µL	195

                                    

蛋白检测

1）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。

2）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液，勿使膜完全干燥。将膜完全浸入发光工作液（125 μL发光工作液/cm²膜）中，与发光工作液充分接触。室温孵育3 min，准备立即压片曝光。

3）用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。

4）在X光胶片暗盒内表面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将印迹膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹印迹膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖印迹膜的保鲜膜固定在暗盒内，蛋白带面向上。

5）暗房内压X光胶片，分别曝光不同的时间，如数秒到数分钟。显影冲洗。（从刚开始的10s曝光时间中可以看出适当的曝光时间。由于检测反应的动力学特征，在孵育后信号立即变得最强，但在随后的2小时内会减弱）

 产品详情：

产品名称	产品编号	规格	目录价/元
Super ECL Detection Reagent ECL化学发光超敏显色试剂盒	36208ES60	100 mL	395
	36208ES76	100 mL	1655

 

 

 

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产品名称	产品编号	规格	目录价/元
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	20123ES50	1瓶（50片）	2353
InStab Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free, 100×DMSO Stock Solution 蛋白酶抑制剂Cocktail，EDTA-free，100×DMSO储液	20124ES03	1 mL	217
	20124ES10	10×1 mL	1587
	20124ES60	100×1 mL	9987
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	36222ES76	500 mL	1255