【可能原因】基线设置不当。

【解决方案】建议增大基线的终点值。调整例图如下：

【可能原因】基线设置过高。

【解决方案】建议减小基线的终点值。调整例图如下：

【可能原因】

1.PCR反应管没有盖紧，反应液泄露。

2.PCR反应液有挂壁。

3.仪器未经过校正（包括自动校正或ROX校正）

4.体系中抑制物较多，导致荧光不稳定。

5.仪器使用过度，导致荧光收集不稳定。

【解决方案】 

1.压紧管盖。

2.试剂彻底混匀，充分离心后，小心放入定量仪器中。

3.校正仪器。

4.提升RNA纯度，选择合适的反转录试剂。

【可能原因】

1.RNA纯度不好，杂质多。

2.仪器使用时间过长。

【解决方案】

1.重新提取高质量的RNA。

2.稀释RNA模板，降低杂质浓度。

3.校正仪器。

【可能原因】 

1.模板浓度低（Ct值35左右）。

2.循环数太少（30cycles）。

3.试剂扩增效率低（Ct小，但也无法达到平台期，曲线比较“趴”）。

【解决方案】 

1.提高模板浓度。

2.增加循环数。

3.增加Mg²⁺浓度。

【可能原因】

1.存在降解（扩增产物降解，SYBR降解）。

2.管盖没有盖好，试剂挥发。

3.模板浓度太高（Ct值太小，荧光阈值拉的高，低头更严重）。

4.管里有气泡，后来气泡消失。

【解决方案】

1.提高体系纯度。

2.降低模板量（稀释模板）。

3.建议减小基线的终点值。

【可能原因】管中含有气泡，加热过程中破裂。

【解决方案】放入仪器前离心混匀保证管中无气泡残留。

【可能原因】

1.模板量低。

2.扩增效率低。

3.PCR产物太长。

4.体系中存在抑制剂。

【解决方案】

1.减少稀释倍数或增加模板量，使Ct值尽量落在15－30之间。

2.优化反应条件，尝试三步法扩增程序或重新设计引物。

3.一般PCR产物长度设计为100 -150 bp之内，不建议超过300bp。

4.建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

【可能原因】

1.加样误差大。

2.试剂和体系未混匀。

3.样品拷贝数低。

4.没有使用Rox校准。

【解决方案】

1. 校准移液器。

2.试剂彻底混匀，配制体系彻底混匀。

3.模板浓度低，重复性差，复孔数4-6个，可适当舍弃1-2个偏差较大数值。

4.最好使用Rox校准。如果使用的试剂不含Rox，需要将参比染料选成None。

【可能原因】Rox浓度和机型不匹配

【解决方案】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常。

【可能原因】引物二聚体导致。

【解决方案】进一步优化引物。

【可能原因】体系有污染。

【解决方案】逐步排查污染源。

【可能原因】

1.与试剂成分，仪器型号有关。

2.存在大小相近的非特异扩增。

【解决方案】

1.起峰到落峰温度跨度不高于7℃ 视为可用结果，即单峰。

2.进行高浓度琼脂糖电泳（如3%琼脂糖）辅助判断。

【可能原因】存在引物二聚体。

【解决方案】提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物。

【可能原因】

1.引物特异性过差导致非特异性产物扩增。

2.gDNA污染。

【解决方案】

1.Blast检查引物特异性，差则重新设计。

2.通过NRC阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

【可能原因】

1.反应体系污染。

2.试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效。

3.仪器长时间未校准。

4.耗材与仪器不匹配。

【解决方案】

1.结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。

2.建议用新的试剂做对比实验。

3.建议定期进行仪器校准保养。

4.需确认对应仪器对耗材的要求。

【可能原因】Rox浓度与机型不匹配。

【解决方案】建议取消Rox校正查看熔解曲线是否正常。调整例图如下：