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细胞转染实验操作注意事项(上)

细胞转染从开始设计到最终的检测,大致可以由6个步骤组成:核酸准备、试剂选择、细胞铺板、转染操作、细胞培养、效果检测。每一步都会影响最终的结果,均存在不同的注意事项。


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一、核酸准备
 
 

A

 质粒的构建

 

(1)强度合适的启动子:在构建表达质粒的时候,有一些基因编码出来的蛋白是对细胞有毒性的蛋白,表达会导致细胞死亡。面对这种情况需选择较弱的启动子或者可以诱导的启动子限制毒性基因产物表达对细胞造成的损害。启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的,对于转染过程本身虽然无甚影响,但是对转染结果却有着微妙的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用,转染也很难进行。
2)siRNA表达载体的使用:这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA,能达到较长时间的基因沉默效果。大大提高siRNA表达载体对宿主细胞的侵染性,彻底克服某些细胞转染效率低的障碍,是实现哺乳动物细胞siRNAs瞬时表达与稳定表达的理想工具。

 

B

 质粒的大小和质量

 

(1)质粒的形态与大小:线性化还是超螺旋会影响转染结果,超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多,特别是瞬时转染。质粒太大了转染会困难一些。
2)核酸质量对转染效率影响非常大:一般的转染技术基于电荷吸引原理,如果不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
用于转染的质粒DNA必须无蛋白质,无RNA和其他化学物质的污染,应确保质粒OD值A260/A280 在1.8~2.0之间。如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
3)内毒素:内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,目前用的质粒大部分是从大肠杆菌中提取出来的。内毒素通常在质粒制备的裂解中释放出来并与质粒DNA共存,内毒素会导致转染效率显著下降,特别是对内毒素敏感细胞比如原代细胞、悬浮细胞和造血细胞或者想要获得最高的转染效率和最低的细胞毒性。

 

C

 质粒共转染

 

合适的比例搭配:对于多个质粒的共转染,每孔DNA的总量不应超过说明书中标明的DNA量。每个质粒的比例根据质粒的大小、结构与预期的各质粒的表达水平而定。在每孔中,每个质粒至少应占总DNA量的10%以上。

 

二、试剂选择
 
 

现在市面上转染试剂种类繁多,质量良莠不齐,如何选择一款合适的转染试剂会显得比较棘手。在考虑合适的转染试剂时,要考虑转染的物质(DNA、RNA、蛋白)以及要转染的细胞特性。
一款好的转染试剂,要具有较高的转染效率,较低的细胞毒性和较合适的价格
不同细胞系转染效率通常不同,但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。罕见的细胞培养,如神经元和原代细胞等通常难以转染,在转染试剂选择时候更需要慎重与预期的降低。

 

三、细胞铺板
 
 

1)细胞状态:健康的细胞培养物是成功转染的基础。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞,细胞生长旺盛,最容易转染。高的转染效率需要一定的细胞密度,一般的转染试剂都会有专门的说明。如为贴壁生长细胞,一般要求在转染前一日,必须应用胰酶处理成单细胞悬液,重新接种于培养皿或,一般转染时贴壁细胞密度为50%-90%,但这个需要参考所选转染试剂的说明书,尽量在细胞最合适的生理状态下转染,以求最佳的转染效果。
2)实验目的:不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度,比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因,就需要较低的铺板密度。

限于篇幅,本次就分享到这里,下半部分将会在后续分享。
如果您在细胞转染过程中遇到问题,可以给我们留言,技术人员会解答您的疑惑。目前翌圣转染试剂系列的产品已经荣登《
Nature》 《Cell》等多个顶级期刊,获得科研大牛们认可!

IF55分!翌圣转染试剂助力高分文章
翌圣明星CP--转染试剂与PCR产品又登《Cell》期刊
以下仅展示部分论文: 

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[1] Liu R, Yang J, et al. Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light-switchable RNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 2022 Jan 3. (IF:55)华东理工大学生物工程学院杨弋团队

[2] Zhou J, Chen P, et al. Cas12a variants designed for lower genome-wide off-target effect through stringent PAM recognition. Mol Ther. 2022 Jan 5.(IF:11.454)武汉大学生命科学学院殷雷团队

[3] Chen S, Cao X, et al. circVAMP3 Drives CAPRIN1 Phase Separation and Inhibits Hepatocellular Carcinoma by Suppressing c-Myc Translation. Adv Sci (Weinh). 2022 Jan 24.(IF:16.808)中国科学院北京生命科学研究院赵方庆团队

[4] Gu C, Wang Y, et al. AHSA1 is a promising therapeutic target for cellular proliferation and proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Jan 6.(11.161)南京中医药大学杨烨顾春艳团队

[5] Zhang Y, Yu X, et al. Splicing factor arginine/serine-rich 8 promotes multiple myeloma malignancy and bone lesion through alternative splicing of CACYBP and exosome-based cellular communication. Clin Transl Med. 2022 Feb.(11.492)南京中医药大学杨烨顾春艳团队

[6] Qin J, Cai Y, et al. Molecular mechanism of agonism and inverse agonism in ghrelin receptor. Nat Commun. 2022 Jan 13.(14.9)四川大学生物治疗国家重点实验室邵振华团队

[7] Tang X, Deng Z, et al. A novel protein encoded by circHNRNPU promotes multiple myeloma progression by regulating the bone marrow microenvironment and alternative splicing. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Mar 8.(11.161)南京中医药大学杨烨顾春艳团队

[8] Xie F, Su P, et al. Engineering Extracellular Vesicles Enriched with Palmitoylated ACE2 as COVID-19 Therapy. Adv Mater. 2021 Oct 19. (IF:30.849)苏州大学生物医学研究院周芳芳团队和浙江大学生命科学研究院张龙团队

[9] Liang Y, Lu Q, et al. Reactivation of tumour suppressor in breast cancer by enhancer switching through NamiRNA network. Nucleic Acids Res. 2021 Sep 7.(IF:16.9)复旦大学生物医学研究院于文强团队

[10] Fan Y, Wang J, et al. CircNR3C2 promotes HRD1-mediated tumor-suppressive effect via sponging miR-513a-3p in triple-negative breast cancer. Mol Cancer. 2021 Feb 2.(IF:27.403)南京医科大学附属逸夫医院苏东明团队

[11] Dai L, Dai Y, et al. Structural insight into BRCA1-BARD1 complex recruitment to damaged chromatin. Mol Cell. 2021 Jul 1.(IF:17.97)浙江大学生命科学研究院黄俊团队和中科院生物物理所周政团队

[12] Zhang K, Wang A, et al. UBQLN2-HSP70 axis reduces poly-Gly-Ala aggregates and alleviates behavioral defects in the C9ORF72 animal model. Neuron. 2021 Jun 16.(IF:17.17)中国科学院生物与化学交叉研究中心王文元团队

[13] Li T, Chen X, et al. A synthetic BRET-based optogenetic device for pulsatile transgene expression enabling glucose homeostasis in mice. Nat Commun. 2021 Jan 27.(IF:14.92)华东理工大学生物工程学院杨弋团队

[14] Pan Y, He X, et al. Neuronal activity recruits the CRTC1/CREB axis to drive transcription-dependent autophagy for maintaining late-phase LTD. Cell Rep. 2021 Jul 20.(IF:9.420)浙江大学脑科学与脑医学学院马欢团队

[15] Liu H, Xing R, et al. G-protein-coupled receptor GPR17 inhibits glioma development by increasing polycomb repressive complex 1-mediated ROS production. Cell Death Dis. 2021 Jun 12.(IF:8.463)厦门大学生命科学学院陈颖团队

[16] Yan F, Huang C, et al. Threonine ADP-Ribosylation of Ubiquitin by a Bacterial Effector Family Blocks Host Ubiquitination. Mol Cell. 2020 May 21.(IF:17.97)浙江大学生命科学研究院朱永群团队

[17] Luo Q, Wu X, et al. TRIM32/USP11 Balances ARID1A Stability and the Oncogenic/Tumor-Suppressive Status of Squamous Cell Carcinoma. Cell Rep. 2020 Jan 7.(IF:9.42)中国医学科学院分子肿瘤学国家重点实验室刘芝华团队

[18] Sun X, Peng X, et al. ADNP promotes neural differentiation by modulating Wnt/β-catenin signaling. Nat Commun. 2020 Jun 12.(IF:14.911)中国科学院水生生物研究所孙玉华团队

[19] Yang X, Wang H, et al. Rewiring ERBB3 and ERK signaling confers resistance to FGFR1 inhibition in gastrointestinal cancer harbored an ERBB3-E928G mutation. Protein Cell. 2020 Dec.(IF:14.872)浙江大学医学院/转化医学研究院闵军霞团队

[20] Zou Y, Wang A, et al. Analysis of redox landscapes and dynamics in living cells and in vivo using genetically encoded fluorescent sensors. Nat Protoc. 2018 Oct.(IF:13.490)华东理工大学生物工程学院杨弋、赵玉政团队

[21] Zhang K, Zhao X, et al. Enhanced Therapeutic Effects of Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes with an Injectable Hydrogel for Hindlimb Ischemia Treatment. ACS Appl Mater Interfaces. 2018 Sep 12.(IF:8.09)南开大学医学院李宗金团队

[22] Hao H, Hu S, et al. Loss of Endothelial CXCR7 Impairs Vascular Homeostasis and Cardiac Remodeling After Myocardial Infarction: Implications for Cardiovascular Drug Discovery. Circulation. 2017 Mar 28.(IF:29.69)中国医学科学院/北京协和医学院阜外医院王淼团队

 

 

 

 

 

 

 

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翌圣生物转染试剂产品目录

应用场景

名称

货号

规格

细胞类型:贴壁/悬浮

核酸类型:DNAsiRNA

Hieff Trans® 脂质体核酸转染试剂

40802ES02

0.5 mL

40802ES03

1.0 mL

40802ES08

5×1 mL

细胞类型:贴壁/悬浮
核酸类型:DNA

磷酸钙法细胞转染试剂

40803ES70

200 T

用途:病毒感染、DNA转染

聚凝胺(10 mg/ml

40804ES76

500 μL

40804ES86

5×500 μL

细胞类型:悬浮
核酸类型:DNAsiRNA

Hieff Trans® 悬浮细胞专用脂质体核酸转染试剂

40805ES02

0.5 mL

40805ES03

1.0 mL

40805ES08

5×1 mL

细胞类型:贴壁/悬浮
核酸类型:siRNAmiRNA

Hieff Trans® siRNA/miRNA体外转染试剂

40806ES01

0.1 mL

40806ES02

0.5 mL

40806ES03

1.0 mL

细胞类型:贴壁/悬浮
核酸类型:DNAsiRNAmiRNA

Hieff Trans® 通用型转染试剂

40808ES02

0.5 mL

40808ES03

1 mL

40808ES08

5×1 mL

细胞类型:贴壁/悬浮
核酸类型:mRNA

Hieff Trans® mRNA转染试剂

40809ES01

0.1 mL

40809ES03

1 mL

细胞类型:贴壁/悬浮
核酸类型:DNA

PEI转染试剂MW25000

40815ES03

1 g

40815ES08

5×1 g

细胞类型:贴壁/悬浮
核酸类型:DNA

线性PEI转染试剂(速溶型)MW40000

40816ES02

100 mg

40816ES03

1 g

细胞类型:293
核酸类型:DNA
用途:AAV/LV载体研发与工艺开发

Hieff Trans® PEI转染试剂

40820ES04

1.5 mL

40820ES10

10 mL

40820ES60

100 mL

细胞类型:293

核酸类型:DNA

用途:AAV/LV载体大规模生产

Hieff Trans® PEI Transfection Reagent-GMP

40821ES10

10 mL

40821ES60

100 mL

40821ES80

1 L


 点击产品名称查看详情

400-6111-883