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常见非编码RNA如何进行反转录?

核糖核酸(RNA)存在于生物细胞、部分病毒以及类病毒中,种类繁多,功能复杂,一般按照是否编码蛋白质将其分为编码RNA和非编码RNA两大类。编码RNA通常指mRNA,非编码RNA则包括很多种类,可以分为长度大于200nt的非编码大RNA、长度小于200nt的非编码小RNA以及特殊的非编码circRNA。非编码大RNA包括rRNA,LncRNA。非编码小RNA包括miRNA、siRNA、piRNA、scRNA等。

 

此外,非编码RNA也可以按照表达和功能特性分为细胞生存所必需的管家非编码RNA和时空特异性表达的调节非编码RNA。

 

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在近些年国自然中标项目中,以非编码RNA为研究主线的主要是miRNA、circRNA、LncRNA和CeRNA,其中CeRNA并不是一种新的RNA分子,只是一种新发现的基因表达调节机制。相较于常见的mRNA反转录不同,上述RNA进行反转录时有着各自的特点与要求。

 

 

miRNA反转录


成熟的miRNA的长度只有20nt左右,通常正向引物就会覆盖其全长甚至会有多余部分,反向引物就无处安置了。目前市面上解决方案就是在反转录时设法增加反转录产物长度。常见的方法有加尾法和茎环法。

 

加尾法利用PolyA 聚合酶为成熟的miRNA加上Poly(A)尾,以带有通用序列的Oligo-dT作为反转录引物,合成加长的miRNA对应cDNA第一链。茎环法以折叠为茎环结构的通用序列作为引物合成加长的miRNA对应cDNA第一链,后续扩增过程中,茎环结构在适宜的温度下会被打开,和相关扩增引物结合。
 

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图. 加尾法合成cDNA

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图.茎环法合成cDNA
 

 

circRNA反转录



circRNA是通过特殊选择性剪切产生的封闭环状结构非编码RNA。不受RNA外切酶的影响,比线性RNA更稳定。由于circRNA没有3‘ poly(A)尾,一般不使用oligo dT作为反转引物,可选用随机引物(random primers N6或N9均可)进行反转录。

 

但需要注意的是,通常提取的RNA中含有大量线性RNA,传统的逆转录酶难以区分环状和线性RNA,建议在进行circRNA反转录时,事先用RNA酶R处理线性RNA以使circRNA得到富集,从而减少错误或偏倚发生。

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图.circRNA反转录合成cDNA
 

 

LncRNA反转录


LncRNA是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA,具有mRNA样结构,经过剪接,有些具有poly(A)尾巴,有些则没有poly(A)尾巴,表达量相对较低。研究表明,LncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥着重要的作用。在进行反转录时,建议选用随机引物(random primers N6或N9均可)或基因特异性引物进行反转录。
 

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图.LncRNA反转录合成cDNA
 

 

产品推荐


翌圣miRNA加尾法反转定量组合(11148ES&11171ES)


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11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

 

试剂盒采用加尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录,产品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反应和反转录反应的所有原料和引物,并经过精心优化,可保证miRNA 3‘末端的Poly(A)修饰过程和反转录过程同时高效进行。

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11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

 

专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂,含有特殊的ROX Passive Reference Dye,适用于所有qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX的浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA 聚合酶采用化学修饰的热启动聚合酶,配合特殊的Buffer体系,使反应特异性更好,灵敏度更高,并能在更广的范围内进行准确定量。

 

产品性能

可兼容全平台qPCR仪器


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图. 以293T细胞的Total RNA为模板,用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录,获得的cDNA稀释10倍后,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6内参基因。

检出率高,最高可达10 pg

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图. 以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T细胞Total RNA(b)为模板,分别稀释成以下梯度:60拷贝到606拷贝(6个梯度)和10 pg-100 ng(5个梯度),用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录,获得的cDNA用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)检测hsa-miR-let-7e-5p基因表达情况。

高特异性,能区分同家族miRNA间单碱基差异

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图. 人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA,彼此间相差的碱基很少,甚至只有单碱基的差异。每个Let-7亚型(hsa-miR-let-7a~Let-7i,has-miR-98)的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录合成cDNA,以不用的引物,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别扩增这些miRNA,利用公式2-ΔCTx 100%计算匹配率。结果显示,可有效区分密切相关的亚型家族成员。


扩增效率出色


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图. 以人293T细胞和鼠源肝脏Total RNA为模板,扩增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。结果显示,与同类产品相比,Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反应体系,具有优异的表现。

 

 

稳定性优秀,在 37℃稳定7天或冻融50次或配置体系在25℃保留48 h,效果依旧稳定

 

图. 以293T细胞Total RNA为模板用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 进行反转录,获得的cDNA稀释10倍,用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表达情况。△Ct<0.5。 

翌圣高效灵活反转录试剂盒(11139ES)


 

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11139ES-Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

 

该试剂盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快,且热稳定性大幅度提高,可耐受高达60℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的反转录。可根据研究的RNA类型,灵活选择所需引物进行反转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的反转录。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升,可合成长达19.8 kb的cDNA。

优越的延伸性能,可合成19.8kb的cDNA


 

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图. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板,oligodT为引物,使用11139ES合cDNA。取1μL cDNA为模板,使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因(19.8kb)的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.

 

线性检测范围广,Total RNA 10pg-5μg


 

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图.以10pg-5μg的293T细胞的总RNA为模板,使用11139ES合成cDNA。取1μL cDNA为模板,使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增基因。 

 

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