常见非编码RNA如何进行反转录？
核糖核酸（RNA）存在于生物细胞、部分病毒以及类病毒中，种类繁多，功能复杂，一般按照是否编码蛋白质将其分为编码RNA和非编码RNA两大类。编码RNA通常指mRNA，非编码RNA则包括很多种类，可以分为长度大于200nt的非编码大RNA、长度小于200nt的非编码小RNA以及特殊的非编码circRNA。非编码大RNA包括rRNA，LncRNA。非编码小RNA包括miRNA、siRNA、piRNA、scRNA等。
此外，非编码RNA也可以按照表达和功能特性分为细胞生存所必需的管家非编码RNA和时空特异性表达的调节非编码RNA。
在近些年国自然中标项目中，以非编码RNA为研究主线的主要是miRNA、circRNA、LncRNA和CeRNA，其中CeRNA并不是一种新的RNA分子，只是一种新发现的基因表达调节机制。相较于常见的mRNA反转录不同，上述RNA进行反转录时有着各自的特点与要求。
miRNA反转录
成熟的miRNA的长度只有20nt左右，通常正向引物就会覆盖其全长甚至会有多余部分，反向引物就无处安置了。目前市面上解决方案就是在反转录时设法增加反转录产物长度。常见的方法有加尾法和茎环法。
加尾法利用PolyA 聚合酶为成熟的miRNA加上Poly(A)尾，以带有通用序列的Oligo-dT作为反转录引物，合成加长的miRNA对应cDNA第一链。茎环法以折叠为茎环结构的通用序列作为引物合成加长的miRNA对应cDNA第一链，后续扩增过程中，茎环结构在适宜的温度下会被打开，和相关扩增引物结合。
图. 加尾法合成cDNA
图.茎环法合成cDNA
circRNA反转录
circRNA是通过特殊选择性剪切产生的封闭环状结构非编码RNA。不受RNA外切酶的影响，比线性RNA更稳定。由于circRNA没有3‘ poly（A）尾，一般不使用oligo dT作为反转引物，可选用随机引物（random primers N6或N9均可）进行反转录。
但需要注意的是，通常提取的RNA中含有大量线性RNA，传统的逆转录酶难以区分环状和线性RNA，建议在进行circRNA反转录时，事先用RNA酶R处理线性RNA以使circRNA得到富集，从而减少错误或偏倚发生。
图.circRNA反转录合成cDNA
LncRNA反转录
LncRNA是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA，具有mRNA样结构，经过剪接，有些具有poly（A）尾巴，有些则没有poly（A）尾巴，表达量相对较低。研究表明，LncRNA在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥着重要的作用。在进行反转录时，建议选用随机引物（random primers N6或N9均可）或基因特异性引物进行反转录。
图.LncRNA反转录合成cDNA
产品推荐
翌圣miRNA加尾法反转定量组合（11148ES&11171ES)
11148ES-Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit
试剂盒采用加尾法来进行miRNA第一链cDNA的反转录，产品中的2×Hifair® miRNA RT buffer包含了miRNA加尾反应和反转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3‘末端的Poly(A)修饰过程和反转录过程同时高效进行。
11171ES -Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix
专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，含有特殊的ROX Passive Reference Dye，适用于所有qPCR仪器，无需在不同的仪器上调整ROX的浓度，只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。DNA 聚合酶采用化学修饰的热启动聚合酶，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。
产品性能
可兼容全平台qPCR仪器
图. 以293T细胞的Total RNA为模板，用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录，获得的cDNA稀释10倍后，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、U6内参基因。
检出率高，最高可达10 pg
图. 以人工合成hsa-miR-let-7e-5p(a)和293T细胞Total RNA(b)为模板，分别稀释成以下梯度：60拷贝到606拷贝（6个梯度）和10 pg-100 ng(5个梯度)，用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录，获得的cDNA用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)检测hsa-miR-let-7e-5p基因表达情况。
高特异性，能区分同家族miRNA间单碱基差异
图. 人类hsa-let-7家族拥有多条miRNA，彼此间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。每个Let-7亚型（hsa-miR-let-7a~Let-7i，has-miR-98）的人工合成miRNA使用 Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)进行反转录合成cDNA，以不用的引物，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)分别扩增这些miRNA，利用公式2-ΔCTx 100%计算匹配率。结果显示，可有效区分密切相关的亚型家族成员。
扩增效率出色
图. 以人293T细胞和鼠源肝脏Total RNA为模板，扩增miR-let-7b-5p、miR-let-7c-5p、miR-let-7e-5p、miR-let-7f-5p基因。结果显示，与同类产品相比，Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES)配套 Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES)的反应体系，具有优异的表现。
稳定性优秀，在 37℃稳定7天或冻融50次或配置体系在25℃保留48 h，效果依旧稳定
图. 以293T细胞Total RNA为模板用Hifair® miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) 进行反转录，获得的cDNA稀释10倍，用Hieff® miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) 检测hsa-miR-let-7b-5p、hsa-miR-let-7c-5p、hsa-miR-let-7e-5p的表达情况。△Ct<0.5。
翌圣高效灵活反转录试剂盒（11139ES)
11139ES-Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)
该试剂盒基于Hifair® III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的反转录。可根据研究的RNA类型，灵活选择所需引物进行反转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的反转录。Hifair® III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可合成长达19.8 kb的cDNA。
优越的延伸性能，可合成19.8kb的cDNA
图. 以500ng 293T细胞的总RNA为模板，oligodT为引物，使用11139ES合cDNA。取1μL cDNA为模板，使用Hieff® Canace Gold 高保真酶(Cat NO.10148ES)扩增DY1C1N1基因（19.8kb）的5’的500bp。M: 1kb DNA ladder.
线性检测范围广，Total RNA 10pg-5μg
图.以10pg-5μg的293T细胞的总RNA为模板，使用11139ES合成cDNA。取1μL cDNA为模板，使用Hieff UNICON® Power qPCR 预混液 (Cat NO.11195ES)扩增基因。
相关产品推荐
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适用RNA类型 |
实验步骤 |
产品名称 |
产品货号 |
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miRNA（加尾法） |
反转录 |
11148ES |
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miRNA（茎环法） |
定量PCR |
11171ES |
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定量PCR |
11170ES |
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mRNA、circRNA、LncRNA、其他小RNA |
反转录 |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus) |
11139ES |
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定量PCR |
11184ES |
