首页/ 产品解读 / 新闻详情

克隆的那些事(上)

克隆,一个大多数实验都绕不开的步骤,一个实验室入门必备技能。但很多刚入门的学弟学妹反映克隆就像一门玄学,时灵时不灵,这是为什么呢?

今天,小翌就带大家好好盘一盘这个克隆里的门道。

 

 

克隆第一步:制备线性化载体

 

首先需要抽提质粒,质粒抽提的方法主要分为乙醇沉淀法和柱提法。质粒提取之后我们可以电泳检测抽提质粒的质量是否合格?抽提出来的质粒一般可以看到三条带:开环质粒、环状质粒和超螺旋质粒(如图1A)。除此之外,还可以采用紫外分光光度计对质粒进行检测,理论认为测出的质粒DNA的OD260/OD280若在1.6-1.8之间,较为纯净,若<1.6,表明有蛋白质、酚等污染,需要进一步纯化,以免影响后续酶切反应。

 

接下来就是载体的线性化,线性化载体的制备大致分为质粒酶切和反向PCR扩增两种,常用的方法为酶切制备线性化载体。良好的线性化载体条带是单一的,往往比超螺旋质粒的位置靠后(如图1A)。那么,如果遇见线性化载体电泳条带弥散(图1B)的情况,该如何处理呢?

 

 

1663730482505125.png1663730482275924.png

 

1.质粒图谱

注:A:酶切完全的质粒图谱(单酶切);B:线性化不完全的质粒

 

若实验中线性化质粒出现多个条带或条带弥散(如图1B),首先需要考虑一下酶切时间是否过长从而导致出现了星星活性,或酶切体系中出现阻遏物。面对此类情况,首先我们要检查一下我们的酶切体系配置的是否合理,反应条件是否按照说明书进行。此处值得注意的是,质粒载体的投入量不宜过多,过多会导致线性化不完全,同时加入的酶量不可超过反应体系的1/10,酶切反应时间过长容易出现星活性,切出拖带。

 

反向PCR制备线性化载体,原理如下图所示。反向PCR的引物方向与常规PCR相反,但其设计原则与常规PCR相同。这种方法常常用来在载体中引入突变。使用反向PCR制备线性化载体时,需要使用高保真酶进行扩增,避免由于长片段扩增带来的点突变等问题。

 

 

1663730652978264.png

2.反向PCR制备线性化载体

 

反向PCR需要注意扩增的产物需要条带单一,若电泳出现非特异性条带则需要通过胶回收切下大小正确的条带。可通过调整PCR的退火温度,提高PCR产物的特异性。同时,建议加入DpnI酶进行质粒模板降解(模板最好来自甲基化功能未损伤的菌株),从而提高克隆的阳性率。

 

 

 

克隆第二步:准备插入片段

 

 

许多刚入门的学弟学妹在设计引物这一关就遇到了拦路虎。那么引物该怎么设计?一步法快速克隆的原理从本质上来讲是同源重组,需要在插入片段的两端加上同源臂,同源臂的长度一般为18-25bp之间。设计出来的引物需要包含两部分:一部分是用来扩增目的片段;一部分是用来与载体退火的同源臂。设计出来的引物要遵循引物设计原则:

 

引物长度:用来扩增目的片段的那部分一般在15~30bp之间,同源臂部分一般在18~25bp之间;

引物GC含量GC含量一般在40-60%之间,过高或者过低都不利于反应。

避免引物出现二级结构:设计引物要避免出现发卡结构,我们可用DNAMAN对引物二级结构进行预测。

多片段同源臂设计注意事项:在进行多片段引物设计时,一般需要保证多片段之间的同源臂一般在15bp左右,在目的片段扩增段,则遵循上述的PCR扩增注意事项。

 

 

1663730795858003.png

3.同源重组流程图

 

设计好引物之后接下来就是PCR产物的扩增,通常情况下,短片段(<1000bp)的克隆是较容易成功的,长片段的同源重组克隆就相对困难。在扩增长片段的目的DNA时,最好优先选择高保真酶,避免扩增出来的片段出现碱基的缺失或改变,试想一下好不容易挑了一堆克隆,就一个阳性,一测序发现碱基错了,氨基酸都变了,岂不是肠子都悔青了。

 

扩增好的PCR产物需要通过电泳检测PCR产物是否特异。好的PCR产物是单一且亮的条带(图4A)。那PCR扩增的片段出现非特异性条带(如图4B),该如何解决呢?

 

 

1663730820685006.png

  图4.PCR产物电泳图

   注:A:特异性扩增PCR产物电泳;B:非特异性扩增PCR产物电泳

 

如果PCR产物出现(图4B)中的非特异性扩增条带。可以尝试通过凝胶电泳将条带跑开,然后将目的大小的条带进行切胶回收。除此之外,可以适当提高退火温度从而提高PCR扩增产物的特异性。如果扩增出来得PCR产物目的条带十分微弱,可以将PCR产物取0.1 µL作为模板尝试进行扩增。扩增好的PCR产物推荐通过胶回收进行纯化以备后续酶连。

 

以上就是线性化载体的制备以及插入片段的制备问题,至于酶连和转化遇到的问题,我们下期再论。

 

 

 

相关产品

 

产品定位

产品名称

产品货号

规格

单片段一步克隆

Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆试剂盒

10911ES20

20T

1-5片段一步克隆

Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆试剂盒

10912ES10

10T

1-6片段一步克隆

Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit

10922ES20

20T

替代TA连接克隆

Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆试剂盒

10907ES20

20T

替代TA连接克隆

Hieff Clone® Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit, MCS-Depleted 零背景TOPO-TA克隆试剂盒(不含MCS多克隆酶切位点)

10908ES20

20T

替代平末端连接克隆

Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒

10909ES20

20T

替代平末端连接克隆

Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit 零背景TOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(不含MCS多克隆酶切位点)

10910ES20

20T

DNA克隆和质粒扩增

TOP10 Chemically Competent Cell TOP10化学感受态细胞

11801ES80

10×100 μL

DNA克隆和质粒扩增

DH5α Chemically Competent Cell DH5α 化学感受态细胞

11802ES80

10×100 μL

非病毒蛋白重组表达

BL21 (DE3) Chemically Competent Cell BL21 (DE3)化学感受态细胞

11804ES80

10×100 μL

常规PCR扩增

2×Hieff®PCR Master Mix (With Dye)

10102ES03

1mL

快速PCR扩增

2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)

10157ES03

1mL

高保真PCR

2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶预混液

10154ES01

100 μL

柱式法核酸提取

MolPure® Plasmid Mini Kit质粒小量提取试剂盒

19001ES50

50T

柱式法核酸提取

MolPure® Endo-free Plasmid Mini Kit 无内毒素质粒小量提取试剂盒

19021ES50

50T

柱式法核酸提取

MolPure® Endo-free Plasmid Maxi Kit无内毒素质粒大量提取试剂盒

19036ES10

10T

柱式法核酸提取

MolPure® Gel Extraction Kit 琼脂糖凝胶回收试剂盒

19101ES50

50T

柱式法核酸提取

MolPure® PCR Purification Kit PCR产物纯化试剂盒

19106ES50

50T

点击产品名称查看详情

400-6111-883