克隆,一个大多数实验都绕不开的步骤,一个实验室入门必备技能。但很多刚入门的学弟学妹反映克隆就像一门玄学,时灵时不灵,这是为什么呢?
今天,小翌就带大家好好盘一盘这个克隆里的门道。
克隆第一步:制备线性化载体
首先需要抽提质粒,质粒抽提的方法主要分为乙醇沉淀法和柱提法。质粒提取之后我们可以电泳检测抽提质粒的质量是否合格?抽提出来的质粒一般可以看到三条带:开环质粒、环状质粒和超螺旋质粒(如图1A)。除此之外,还可以采用紫外分光光度计对质粒进行检测,理论认为测出的质粒DNA的OD260/OD280若在1.6-1.8之间,较为纯净,若<1.6,表明有蛋白质、酚等污染,需要进一步纯化,以免影响后续酶切反应。
接下来就是载体的线性化,线性化载体的制备大致分为质粒酶切和反向PCR扩增两种,常用的方法为酶切制备线性化载体。良好的线性化载体条带是单一的,往往比超螺旋质粒的位置靠后(如图1A)。那么,如果遇见线性化载体电泳条带弥散(图1B)的情况,该如何处理呢?
图1.质粒图谱
注:A:酶切完全的质粒图谱(单酶切);B:线性化不完全的质粒
若实验中线性化质粒出现多个条带或条带弥散(如图1B),首先需要考虑一下酶切时间是否过长从而导致出现了星星活性,或酶切体系中出现阻遏物。面对此类情况,首先我们要检查一下我们的酶切体系配置的是否合理,反应条件是否按照说明书进行。此处值得注意的是,质粒载体的投入量不宜过多,过多会导致线性化不完全,同时加入的酶量不可超过反应体系的1/10,酶切反应时间过长容易出现星活性,切出拖带。
反向PCR制备线性化载体,原理如下图所示。反向PCR的引物方向与常规PCR相反,但其设计原则与常规PCR相同。这种方法常常用来在载体中引入突变。使用反向PCR制备线性化载体时,需要使用高保真酶进行扩增,避免由于长片段扩增带来的点突变等问题。
图2.反向PCR制备线性化载体
反向PCR需要注意扩增的产物需要条带单一,若电泳出现非特异性条带则需要通过胶回收切下大小正确的条带。可通过调整PCR的退火温度,提高PCR产物的特异性。同时,建议加入DpnI酶进行质粒模板降解(模板最好来自甲基化功能未损伤的菌株),从而提高克隆的阳性率。
克隆第二步:准备插入片段
许多刚入门的学弟学妹在设计引物这一关就遇到了拦路虎。那么引物该怎么设计?一步法快速克隆的原理从本质上来讲是同源重组,需要在插入片段的两端加上同源臂,同源臂的长度一般为18-25bp之间。设计出来的引物需要包含两部分:一部分是用来扩增目的片段;一部分是用来与载体退火的同源臂。设计出来的引物要遵循引物设计原则:
引物长度:用来扩增目的片段的那部分一般在15~30bp之间,同源臂部分一般在18~25bp之间;
引物GC含量:GC含量一般在40-60%之间,过高或者过低都不利于反应。
避免引物出现二级结构:设计引物要避免出现发卡结构,我们可用DNAMAN对引物二级结构进行预测。
多片段同源臂设计注意事项:在进行多片段引物设计时,一般需要保证多片段之间的同源臂一般在15bp左右,在目的片段扩增段,则遵循上述的PCR扩增注意事项。
图3.同源重组流程图
设计好引物之后接下来就是PCR产物的扩增,通常情况下,短片段(<1000bp)的克隆是较容易成功的,长片段的同源重组克隆就相对困难。在扩增长片段的目的DNA时,最好优先选择高保真酶,避免扩增出来的片段出现碱基的缺失或改变,试想一下好不容易挑了一堆克隆,就一个阳性,一测序发现碱基错了,氨基酸都变了,岂不是肠子都悔青了。
扩增好的PCR产物需要通过电泳检测PCR产物是否特异。好的PCR产物是单一且亮的条带(图4A)。那PCR扩增的片段出现非特异性条带(如图4B),该如何解决呢?
图4.PCR产物电泳图
注:A:特异性扩增PCR产物电泳;B:非特异性扩增PCR产物电泳
如果PCR产物出现(图4B)中的非特异性扩增条带。可以尝试通过凝胶电泳将条带跑开,然后将目的大小的条带进行切胶回收。除此之外,可以适当提高退火温度从而提高PCR扩增产物的特异性。如果扩增出来得PCR产物目的条带十分微弱,可以将PCR产物取0.1 µL作为模板尝试进行扩增。扩增好的PCR产物推荐通过胶回收进行纯化以备后续酶连。
以上就是线性化载体的制备以及插入片段的制备问题,至于酶连和转化遇到的问题,我们下期再论。
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