背景介绍

荧光素酶生物检测技术诞生于1990年，已有30年的发展史。单荧光素酶检测系统到双荧光素酶检测系统的发展，为科研人员提供了更为严谨的实验手段。双荧光素酶报告基因检测系统在原有的基础上引入了海肾报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。其发光原理如下图1。

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图1. 双荧光素酶发光原理

实验方案

将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR区或lncRNA结合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究启动子的强弱和转录因子对启动子的作用或miRNA对目的基因或lncRNA的调控作用。如图2。

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图2. 报告基因系统用于基因表达调控研究

实验应用

1）启动子、增强子、转录因子的研究；

2 ) 信号转导通路的研究；

3) 蛋白质相互作用；

4) miRNA、LncRNA、siRNA等的研究。

……

双报告基因检测试剂盒多用于动物细胞中，也有相关科研人员以植物为研究对象。不同的研究对象其操作流程有一定的差异。这里为大家提供细胞、烟草叶片和原生质体这三种研究对象对应的操作流程：

01

细胞篇

1、制备重组质粒

2、共转染：将Luc/Ren载体和目的基因载体进行共转染，通常24-48h(选择转染效率较高的细胞如293T)，载体的转染比例要进行摸索（如1:10、1:20、1:50、1:100），原则上海肾荧光素酶读值不盖过主报告基因读值为好。具体的转染流程参照相关说明书；

3、细胞裂解处理

a：对于贴壁细胞，吸尽细胞培养液，按照下表比例加入细胞裂解液，轻轻旋转培养皿或者培养板使裂解液完全覆盖细胞；

b: 对于悬浮细胞，离心弃去上清，按照下表比例加入裂解液；

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冰上孵育5min，充分裂解细胞。10000-16000rpm离心1min，取上清；

4、荧光检测（使用含有生物发光或化学发光模块的酶标仪）

取20 μL细胞裂解液，加至黑色酶标板中。加入100 μL 1×萤火虫荧光素酶反应液，震板混匀，检测萤火虫荧光素酶的活力; 加入100 μL 1×海肾荧光素酶反应液，检测海肾荧光素酶的活力。两个反应最好都在30min完成。

5、数据分析：实验结果为Luc值与Ren值之比。

02

烟草叶片篇

1、制备重组质粒

2、农杆菌转化及培养：质粒转化比例需要摸索。转化后需过夜培养，OD600达到0.8以上即可；

3、利用无针头注射器注射叶片，（先用针头在叶片上扎个小孔）（注射烟草顶端以下第3-5片叶片）；

4、暗培养1d，光照培养2d;

5、取叶片进行打孔，8mm-1.5cm即可;

6、在2mL的EP管中加入预冷的小钢珠，放入3-4片烟草叶盘并加入适量的液氮，使用仪器进行研磨破碎（45Hz，30s），加入100μL裂解液，10000-16000rpm离心2min，取上清20μL进行检测。

7、检测：方法同动物细胞。

03

原生质体篇

1、原生质体的制备：不同植物原生质体的分离略有差异，请参考相关文献；

2、原生质体的计数与活力测定：取少量原生质体稀释液滴加在0.1mm的血球计数板上，在光学显微镜下观察计数。用0.01% FDA进行染色，在显微镜下对发绿色荧光的原生质体进行计数。计算原生质体的活力。

3、构建重组载体；

4、PEG-Ca²⁺介导原生质体的转化：用MMG溶液重悬原生质体。在1.5mL EP管中加入Luc、Ren载体（比例需摸索）、100μL 原生质体和110μL PEG4000-Ca²⁺溶液，黑暗处放置20min，加入W5终止反应，离心弃上清，用1mL W1溶液重悬原生质体并转移至细胞培养板中，25℃静置培养20h；

5、原生质体的裂解：将原生质体加入2mL离心管中，离心收集原生质体，加入100μL左右的裂解液，冰上孵育10min左右。10000-16000rpm离心5min。

6、检测：取20μL上清至1.5mL EP管中，检测方法同动物细胞。

FAQ

Q1：如何选择海肾报告基因质粒？

A1：尽量选择中等强度的启动子，如TK启动子等，不要选择强启动子CMV、SV40等。海肾基因的表达活性应显著高于背景组，同时不干扰萤火虫荧光素酶报告基因的表达。

Q2：如何选择萤火虫报告基因质粒？

A2：原则上含有luc基因就可以，但是不同实验所需的载体有一定差异，如研究miRNA、转录因子的载体是不同的。小翌为大家提供了多种研究转录因子活性的报告基因载体，可以直接使用，详情见官网（https://www.yeasen.com/products/min/101），如果您要自己构建载体，要注意有些载体没有启动子，需要自行插入启动子，如pGL3 Basic。

Q3：psiCHECK-2的主报告基因是海肾报告基因，而不是萤火虫报告基因，能用于双荧光素酶报告基因检测实验吗？

A3：该质粒可以用于双荧光素酶报告基因检测实验，本试剂盒的检测原理是酶和底物的反应，两种酶经裂解处理后都会释放出来，所以使用该质粒不影响检测实验。最后的数值为Ren值与Luc值之比。

Q4：检测体系可以自行调整吗？

A4: 我们推荐20μL裂解液，100μL萤火虫荧光素酶底物，100μL海肾荧光素酶底物。底物的量可以适当调整，但是要保证底物是足量的。

Q5：数值低，什么原因造成的？

A5：可能是启动子活性、转染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不规范等原因造成的，具体的原因需要实验者进行排查。

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