导读

水、土壤、空气——这些构成地球生态基础的要素中，蕴藏着数以亿计的微生物。它们是环境健康的“守门人”，也是污染风险的“预警器”。然而，传统培养法仅能检测环境中不足1%的微生物，绝大部分“暗物质”长期游离于监测视野之外。高通量测序（NGS）技术的成熟，正在重塑环境微生物监测的范式。从污水厂工艺优化到城市空气病原体预警，NGS解决方案正以“全景式扫描”的视角，为环境监测、公共卫生及生态修复提供前所未有的数据支撑。本文将系统梳理环境微生物监测NGS技术的原理、应用场景、标准流程及未来趋势。

一、背景：环境监测进入“分子时代”

传统环境微生物监测依赖培养法和定量PCR（qPCR）。培养法耗时长、漏检率高，大量不可培养微生物被忽略；qPCR虽灵敏，但只能针对已知靶标，无法应对未知病原体的突发威胁。

高通量测序技术的出现彻底改变了这一局面。它不依赖于培养，无需预设靶标，可一次性获取样本中所有微生物的遗传信息，实现真正的“无偏倚”检测。根据研究目标的不同，环境微生物NGS监测主要分为三条技术路径，三者互为补充，共同构建从“谁在”到“在做什么”的完整认知链条：

扩增子测序（16S/ITS/18S）：靶向特定系统发育标记基因，适用于物种组成分析。16S rRNA基因（细菌/古菌）、ITS区域（真菌）、18S rRNA基因（真核微生物）是三大核心靶点。它以低成本、高灵敏度成为环境微生物多样性研究的“入门级”工具。

宏基因组测序（Shotgun Metagenomics）：对环境总DNA进行全基因组鸟枪法测序，同时解析物种组成和功能基因谱，尤其适用于抗生素抗性基因（ARGs）、毒力因子、代谢通路的挖掘。它回答了“这里有什么功能潜力”的问题。

宏转录组测序（Metatranscriptomics）：以环境样本中的全部RNA为研究对象，反映特定条件下活跃表达的微生物及其功能基因。它能有效剔除死亡微生物的信息，从转录水平揭示微生物群落对环境的实时响应。它回答了“哪些微生物正在工作？它们在执行什么功能？”——这是从“存在”走向“活性”的关键跃迁。

图1 不同测序方法之间的比较（图片来源：网，侵删）

二、技术应用：覆盖环境监测全场景的“组合拳”

1. 污水处理工艺优化（宏基因组+宏转录组）

活性污泥是污水处理的核心“反应器”，其微生物群落结构直接影响污染物去除效率。通过宏基因组测序，可系统解析污泥中功能菌群的组成；而宏转录组则进一步揭示这些菌群是否真正活跃表达。

图2 污水处理系统研究流程图（图片来源：网，侵删）

2. 土壤生态过程与元素循环机制（扩增子+宏基因组+宏转录组）

土壤是地球上最复杂的微生物生态系统。扩增子测序可快速揭示不同处理下的群落组成变化；宏基因组则挖掘参与碳、氮、硫循环的功能基因库；宏转录组在解析元素循环耦合机制方面展现出独特价值。

3. 工业污染场地修复的功能评估（宏基因组+宏转录组）

污染土壤中，降解菌的存在并不等于降解活性的存在。宏基因组可识别降解基因的丰度，宏转录组则直接检测关键降解基因（如alkB、CYP450、pmoA）的转录水平，评估生物刺激策略的效果。

4. 城市水系统病原体监测与溯源（宏基因组+扩增子）

污水流行病学已成为公共卫生监测的前沿阵地。华大智造联合香港大学开发的污水微生物测序组合产品，集成多重PCR与宏基因组测序，可同时监测新冠病毒谱系分布、微生物物种构成及抗生素抗性基因丰度。

三、常见实验步骤

1. 样本采集与保存

不同环境介质的采样要求各异，以下内容供参考：

污水/水样：根据浊度选择过滤体积（清洁水>2 L，浊水0.5–1 L），采用0.22 μm滤膜富集微生物。便携智能采样器支持现场过滤及0-4℃冷藏运输。

土壤/污泥：采集后立即液氮速冻或-80℃保存，避免反复冻融。

空气：采用AirSeq等专用采样设备，结合高效空气过滤与核酸提取流程。

2. 核酸提取

DNA提取：环境样本富含腐殖酸、重金属、多酚等PCR抑制剂，提取质量直接影响建库成败。采用机械裂解（0.1 mm锆珠震荡）+化学裂解双重破壁，确保有效提取。

RNA提取：宏转录组对RNA完整性和纯度要求更高：

全程在无RNase环境下操作，使用DEPC处理耗材。提取后RNA需检测OD260/280及完整性。

3. 文库构建

根据测序目标选择建库策略：

16S/ITS扩增子建库：采用两步PCR法，靶向V3-V4区或ITS等区域。

宏基因组建库：采用酶切法或超声打断片段化DNA，经末端修复、加A尾、连接接头后PCR扩增。也可以基于Tn5转座酶的“一步法”建库试剂盒可在2.5小时内完成建库，起始量低至1 ng。

宏转录组建库：流程相对复杂：

rRNA去除：总RNA中rRNA占比超过90%，需通过探针杂交去除。

链特异性建库：逆转录合成cDNA第一条链后，第二链合成时以dUTP取代dTTP，保留链方向信息。链特异性文库可提供更精准的基因定量和反义转录本信息。

扩增与纯化：PCR扩增后磁珠纯化，质检合格后上机。

4. 高通量测序

扩增子测序：Illumina /MGI平台，PE250或PE300模式，每个样本建议5-10万条序列。

宏基因组测序：Illumina /MGI平台，PE150模式，数据量10-20 Gb/样本。

宏转录组测序：建议数据量10-20 Gb/样本，以覆盖低丰度转录本。长读长平台（Oxford Nanopore）可实现RNA直接测序，避免逆转录引入的偏向性。

5. 生物信息分析

核心分析内容：

质控与去噪：FastQC、cutadapt、DADA2

物种注释：SILVA、Greengenes、Kraken2、MetaPhlAn4

功能注释：PICRUSt2、HUMAnN3、KEGG、COG

抗性基因分析：ARGs-OAP v3.0

高级分析：共现网络（Cytoscape）、环境因子关联（RDA/CCA）、物种-功能关联：将转录本同时注释物种来源和功能，解析“谁在表达什么基因”。

四、总结：从“看得见”到“看得清、看得懂”

对于环境管理者与科研人员而言，选择NGS监测方案的核心不在于技术本身的先进性，而在于研究目标与检测策略的精准匹配：是需要物种清单（扩增子），还是功能图谱（宏基因组）？是否需要实时活性（宏转录组）？是需要相对变化，还是绝对浓度？唯有在每一个环节做出理性决策，才能真正发挥NGS技术“解码生态密码”的潜力。

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