人Th17细胞极化细胞因子套装 Human Th17 Cell Polarization Cytokine Set（92681ES）

本套装专为人初始 Naive CD4⁺T 细胞体外定向诱导分化为 Th17 细胞设计，采用经过验证的细胞因子 + 抗体组合，可高效驱动 Naive CD4⁺T 向 Th17 亚型极化，稳定获得 IL-17A 阳性 Th17 细胞，适用于免疫学机制研究、细胞功能验证、重组蛋白活性检测、药物筛选等体外细胞实验。配套方案成熟，操作简单。

产品组分

注：部分试剂可能有剩余

复溶方法

人Th17极化套装操作流程

1. 包被anti-human CD3 mAb以激活T细胞

1.1使用无菌PBS将anti-human CD3 mAb稀释至工作浓度（5 µg/mL）。

1.2将稀释后的anti-human CD3 mAb按每孔1mL加入24孔细胞培养板中包被，在37°C条件下孵育2小时，或在4°C下孵育过夜。

2. 接种细胞并启动Th17极化

T 细胞极化实验中，需将细胞重悬于完全培养基，细胞稀释浓度与铺板密度二者都很关键，以此保证细胞获得最佳刺激与生长状态。

2.1次日，吸弃孔内包被液，用预冷的无菌PBS轻柔洗涤孔板2-3次，以去除未结合的抗体。

2.2将CD4⁺ T细胞分选试剂（CD4 Nanobeads，货号37605ES10）分选获得的初始CD4+ T细胞，以 1×10^6 cells/mL的浓度重悬于Th17极化完全培养基中。

Th17极化完全培养基配方：RPMI-1640基础培养基，补充10% FBS、55 μM β-巯基乙醇、30ng/mL重组人IL-6、20 ng/mL重组人IL-23、20ng/mL重组人IL-1β、10ng/mL重组人TGF-β1、10 μg/mL anti-human IL-4中和抗体、10 μg/mL anti-human IFN-γ中和抗体及1 μg/mL anti-human CD28 mAb。

2.3取1mL细胞悬液接种至已包被的24孔板中。置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。

3. 培养维持与细胞扩增

3.1培养48小时后，轻柔吹打并收集细胞悬液，300×g离心5分钟。

3.2弃上清，用新鲜的Th17极化完全培养基将细胞重悬，并将细胞密度调整至 3-5×10^5 cells/mL，重新接种至新孔板中继续培养。（细胞量多，体积大可选择接种至6孔板中，每孔2-3mL。）

3.3此后，每12小时在倒置显微镜下观察细胞密度及状态。第4天时，镜下观察可以看到细胞成团并聚集在孔板中央，补充与孔板中培养基相同体积的新鲜Th17极化完全培养基，并添加相应浓度的细胞因子及抗体，以维持细胞最佳生长状态。

4. 细胞再刺激与胞内因子捕获

培养至第5天，收集细胞，用预冷的PBS洗涤一次后，使用含 10 ng/mL PMA、1 µg/mL Ionomycin及10 µg/mL Brefeldin A 的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，调整密度至 1×10^6 cells/mL，于37°C、5% CO₂培养箱中避光共刺激孵育5小时。

阴性对照组（Th0）设置

为评估极化的特异性，平行设置Th0阴性对照组。其流程与上述Th1诱导组基本相同，主要区别在于所使用的培养基不同：

1. Th0维持培养基配方：RPMI-1640基础培养基补充10 % FBS，55 μM β-巯基乙醇，10μg/mL Anti-human IL-4，

10μg/mL Anti-Human IFN-γ，200U/ml IL-2及1 µg/mL anti-human CD28 mAb。

2. 不添加极化细胞因子：该培养基中不添加极化细胞因子。

3. 阴性对照组不需要PMA、Ionomycin和 Brefeldin A处理5h。除上述差异外，细胞接种、换液、密度监控均与Th17诱导组相同。

流式细胞术检测

1. 收集细胞：细胞诱导后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹打重悬；

2. 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，300×g，离心5min，弃上清；

3. 死活染料染色：按照1e6/100μL浓度加入稀释好的死活染料；

4. 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，300×g，离心5min，去除残留的死活染料；

5. 细胞固定：用PBS将细胞按照1e7/ml重悬，100μL/孔加至96孔板，300×g，离心5min，弃上清；每孔加入200μL 4% PFA，室温避光放置15min；

6. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μL PBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留的固定剂；

7. 细胞破膜：每孔加入200μL fixation/permeabilization solution（BD 554714），4~8℃冰箱孵育30min；

8. 细胞封闭：每孔加入100μL 1×BD Perm/Wash™ Buffer，并加入Human IgG进行细胞封闭（步骤7与步骤8可同时进行），随后300×g，离心5min，弃上清；

9. 孵育抗体：每孔加入100μL 1×BD Perm/Wash™ Buffer并加入孵育抗体IL-17A Monoclonal Antibody, PE-Cyanine7 (抗体用量参考说明书）；

10. 洗涤细胞：300×g，离心5min，弃上清；每孔加200μL PBS，300×g，离心5min洗涤细胞，去除残留抗体，随后用100μL-200μL重悬细胞；

11. 上机检测。

1.配方精准优化，定向分化效率高

2.全组分人源化，细胞活性优异

3. 批间质控严格，实验重复性稳定