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产品简介
UCF.ME® UltraNuclease（全能核酸酶），又称非限制性核酸内切酶、广谱核酸酶；是一种来源于Serratia Marcescen的非特异性核酸内切酶，可在链内任意核苷酸间进行切割，将核酸完全消化成2-5个碱基长度的5'-单磷酸寡核苷酸，能够在非常广泛的条件下(6 M Urea, 0.1 M Guanidine HCl, 0.4% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF)降解各种形式的（双链、单链、线状、环状、天然或变性）DNA和RNA，广泛用于去除生物制品中的核酸。后续也可以通过相应的方法去除UCF.ME® UltraNuclease。
本试剂盒应用双抗体夹心酶联免疫检测（夹心ELISA）原理检测变性与非变性的UCF.ME® UltraNuclease全能核酸酶的残留，用抗UCF.ME® UltraNuclease的兔多克隆抗体包被微孔板，形成固相抗体，向固相抗体酶标板(36701-A)中加入UCF.ME® UltraNuclease标准品(36701-C)和待测样品，然后加入稀释后的生物素标记的全能核酸酶检测抗体(36701-B)，最后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SA-HRP) (36701-D)，形成抗体+抗原+抗体-Biotin + SA-HRP复合物，洗板后加入TMB显色液(36701-H)显色。TMB在HRP酶的催化下由无色转化成蓝色并在终止液(36701-I)的作用下最终转化成黄色。黄色的深浅与样品中被检测到的UCF.ME® UltraNuclease的量呈正相关。
组分信息
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组分编号 |
组分名称 |
36701ES96 |
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36701-A |
酶标板 |
1 Plate |
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36701-B |
Detection Antibody: Biotin-conjugated Rabbit Anti-UltraNuclease Antibodies |
10 μL |
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36701-C |
Standard: UCF.ME® UltraNuclease |
1 vial (500 ng/mL) |
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36701-D |
HRP-conjugated Streptavidin |
10 μL |
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36701-E |
Dilution Buffer 1 |
45 mL |
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36701-F |
20×Wash Buffer |
50 mL |
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36701-G |
Dilution Buffer 2 |
50 mL |
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36701-H |
TMB |
15 mL |
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36701-I |
Stop Solution |
10 mL |
|
36701-J |
封板膜 |
5片 |
储存条件
2~8℃保存*，未拆封有效期1年，拆封后有效期1个月。
*收到货后，请检查各组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。
使用说明
- 实验前准备
1）本试剂盒未提供，但实验所需的实验材料：
a. 量筒、1000 mL烧杯、不同规格的EP管
b. 无尘纸（用于洗板后拍板）
c. 无菌吸头
d. 样本前处理板
e. 去离子水或双蒸馏水
2）本试剂盒未提供，但实验所需的实验设备和仪器：
a. 37℃恒温箱
b. 全自动洗板机（可选）、涡旋混匀仪、离心机
c. 不同规格的精密微量移液器、多通道微量移液器
d. 计时器、4℃冰箱
e. 酶标仪（如：Molecular Devices：M和i系列）在450 nm测量吸光度(参比波长630 nm)
- 实验方法
1）试剂、抗体准备
使用前所有试剂组分以及待测样本需要恢复室温。
- 1×Wash Buffer配制：
浓缩液平衡至室温，充分溶解，不要有结晶。混匀后根据所需的量，用超纯水按1:20的比例，将浓缩洗液(20×)稀释20倍，最终得到1×洗液。如：取50 mL浓缩洗液即20×Wash Buffer加入950 mL超纯水中，配成1000 mL 1×洗液。若20×Wash Buffer中出现结晶，在50℃的水浴锅中温浴，直至结晶完全消失。
- Detection Antibody配制：
使用前10000 rpm离心20 sec，然后用Dilution Buffer 2将检测抗体以1:2500稀释至工作浓度使用。
- Streptavidin-HRP配制：
使用前10000 rpm离心20 sec，然后用Dilution Buffer 2以1:5000稀释至工作浓度使用。
2）标准品溶液制备
提前准备8个无菌的1.5 mL离心管，按照标准品浓度依次进行标记。移取994 μL Dilution Buffer 1至标记为3 ng/mL的离心管中，其余各管移取500 μL。根据标准品储存液浓度计算3 ng/mL标准品应移取的储液体积，加至标记为3 ng/mL的离心管中混匀。再取500 μL至下一个标记浓度的离心管中，混匀，进行一系列2倍梯度稀释标品。
起始最高浓度标记3 ng/mL，最低浓度为0.047 ng/mL，可按照下面的配制方法来进行。每次试验均需制备相应的标准曲线，不同试剂盒以及不同时间的标准曲线不能混用。样本测试时，每个孔所需标品量为100 μL，注意配制体积要高于所需体积，避免体积使用量不足。
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图1 UCF.ME® UltraNuclease标准品制备流程图
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管号 |
Dilution Buffer 1体积(μL) |
加入的标准品和体积(μL) |
标准品终浓度(ng/mL) |
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A |
994 |
6 (500 ng/mL) |
3 |
|
B |
500 |
500 A |
1.5 |
|
C |
500 |
500 B |
0.75 |
|
D |
500 |
500 C |
0.375 |
|
E |
500 |
500 D |
0.188 |
|
F |
500 |
500 E |
0.094 |
|
G |
500 |
500 F |
0.047 |
|
H |
300 |
0 |
0=Blank |
表1 UCF.ME® UltraNuclease标准品体系配制（酶标仪检测0.047~3 ng/mL）
3）待测样本制备
将样本按照一定的稀释倍数进行稀释。样本具体的稀释倍数，需要通过样本加标，评估加标回收率和稀释线性后，确定合适的稀释倍数。
4）实验步骤
使用前所有试剂组分以及待测样本需要恢复室温。强烈建议所有的标准品和待检样本进行双复孔测定。
- 试剂准备：提前准备好各种待测试剂、稀释好的标准品和待测样本。
- 酶标板条确定：计算待测样本和标准品所需酶标板条，将酶标条从铝箔袋取出，剩余的酶标条放回铝箔袋中并封好袋口，低温保存。
- 清洗酶标板：用1×Wash Buffer（300 μL/孔）洗板三次，拍干酶标板。洗板对实验结果有重要影响，确保最后一次拍板没有洗液残留。
- 孵育样本：加入标准品和待测样本，100 μL/孔，确保15 min内完成点样，37℃孵育1 h。
- 清洗酶标板：弃去孔中液体，加入1×Wash Buffer（300 μL/孔）洗板五次，拍干酶标板。
- Detection Antibody即Biotin-conjugated Antibodies孵育：将预先配制至工作浓度的检测抗体加入酶标板，100 μL/孔，37℃孵育1 h。
- 清洗酶标板：弃去孔中液体，加入1×Wash Buffer（300 μL/孔）洗板五次，拍干酶标板。
- HRP-conjugated Streptavidin孵育：将预先配制至工作浓度的偶联HRP的链霉亲和素加入酶标板，100 μL/孔，37℃孵育40 min。
- 清洗酶标板：弃去孔中液体，加入1×Wash Buffer（300 μL/孔）洗板五次，拍干酶标板。
- 显色：使用前10 min将底物液恢复至室温，将底物液TMB加入酶标板中，100 μL/孔，37℃避光孵育15 min。
- 终止：加入50 μL/孔终止液至酶标板中，轻轻震动酶标板至显色均匀。
- 读值：20 min内读取450 nm/630 nm波长处的吸光度值。450 nm作为检测波长，630 nm作为参比波长。
5）结果分析
a. 如果待测样本OD值超出标准曲线最高点OD值，需将样本进行稀释后重新测定。
b. 曲线制定：以标准品浓度为横坐标，校准后的标准品吸光度值（OD 450 nm-630 nm）为纵坐标绘制标准曲线。多种绘图和统计学软件可以用于辅助绘制标准曲线并进行未知样本浓度的计算。四参数拟合法往往曲线拟合效果较好，其它方法如线性，双对数法也可能获得较好拟合结果，需要根据具体实验数据进行分析。最终依据标准曲线和样本的稀释倍数计算样本中宿主蛋白浓度。
c. 典型的参考标准曲线如下（以下标准曲线图仅供参考，应以同次实验标准品所绘标准曲线计算样本含量）：
|
标曲（ng/mL） |
OD |
平均OD |
校准值 |
|
|
3.000 |
2.205 |
2.189 |
2.197 |
2.198 |
|
1.500 |
1.520 |
1.543 |
1.532 |
1.528 |
|
0.750 |
0.974 |
0.962 |
0.968 |
0.971 |
|
0.375 |
0.579 |
0.588 |
0.584 |
0.587 |
|
0.188 |
0.353 |
0.351 |
0.352 |
0.353 |
|
0.094 |
0.228 |
0.221 |
0.225 |
0.221 |
|
0.047 |
0.154 |
0.155 |
0.155 |
0.150 |
|
0.000 |
0.070 |
0.067 |
0.069 |
0.074 |
图2：UCF.ME® UltraNuclease标准曲线图 表2 UCF.ME® UltraNuclease标准曲线数据
6）实验流程图
图3：实验步骤流程简图
产品性能
本试剂盒性能经过充分评估，标曲范围为0.047~3 ng/mL，板内精密度CV<10%和板间精密度CV<15%，准确度满足75%~125%范围，检测限为0.0235 ng/mL（即23.5 pg/mL）。
注意事项
1）使用本试剂盒前请仔细阅读本说明书；
2）请在有效期内使用该产品，禁止不同批次的相关试剂进行混用；
3）所有试剂在使用之前，均需要恢复至室温；
4）本产品仅能够应用于检测说明书中标注的靶点抗原与样本。其它应用需经使用者设计验证后，根据结果评估使用的可靠性与准确性；
5）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
6）本产品仅用作科研用途。
Ver.CN20240618
