DNA文库制备 | 大刺鳅\牡蛎\扇贝\小龙虾水产样本全基因组测序
10934
2026-02-09
实验所用试剂清单
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类别 |
货号 |
产品名称 |
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DNA建库 |
Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V4 一步法DNA酶切建库试剂盒V4 |
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磁珠 |
Hieff NGS® DNA selection Beads (Superior Ampure XP alternative)DNA纯化分选磁珠 |
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定量 |
1× dsDNA HS Assay Kit 即用型dsDNA qubit定量试剂 |
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接头 |
Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®, Set4（1152种Illumina双端唯一接头，板式接头，set4） |
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自备材料 |
— |
无水乙醇 |
实验前准备
1、磁珠使用前应先平衡至室温；
2、配制80%乙醇
3、接头4倍稀释。
4、按照下表中的量准备样本。
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实验编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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物种 |
大刺鳅 |
大刺鳅 |
大刺鳅 |
牡蛎 |
牡蛎 |
牡蛎 |
扇贝 |
扇贝 |
扇贝 |
小龙虾 |
小龙虾 |
小龙虾 |
实验条件
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建库方式 |
自动化设备建库AMTK ilab300 |
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input |
500 ng |
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片段化 |
4℃ 1min，35℃ 15 min，72℃ 20min，4℃ hold |
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Adapter |
Illumina 短接头，4倍稀释 |
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连接后纯化、分选比例 |
连接后0.6×纯化、 分选0.65×/0.15× |
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扩增循环数 |
7 cycles |
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扩增后纯化比例 |
0.9×纯化 |
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文库洗脱 |
23 μL |
操作步骤
一、DNA片段化/末端修复/dA尾添加 (DNA Fragmentation/End Repair/dA-Tailing)
将表1各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。于冰上配制表1反应体系，使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。参考表格反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。
表1. DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应
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反应体系 |
反应程序 |
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名称 |
体积 (μL) |
温度 |
时间 |
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Input DNA |
500 ng |
热盖105℃ |
On |
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Smearase® Buffer 4.0 |
10 |
4℃ |
1 min |
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Smearase® Enzyme 4.0 |
10 |
35℃ |
15 min |
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ddH2O |
Up to 60 |
72℃ |
20 min |
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- |
- |
4℃ |
Hold |
二、接头连接 (Adapter Ligation)
需要根据Input DNA量稀释Adapter至合适浓度，本次使用的UDI接头稀释4倍。
将表2中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。于冰上配制表1反应体系，使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。参考表2设置反应程序，进行接头连接反应。
表2. 接头连接反应
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名称 |
体积 (μL) |
温度 |
时间 |
|
dA-tailed DNA |
60 |
- |
- |
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Ligation Enhancer 4.0 |
30* |
热盖 |
Off |
|
Rapid DNA Ligase 4.0 |
10 |
20℃ |
15 min |
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PE Adapter |
5 |
4℃ |
Hold |
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ddH2O |
Up to 110 |
- |
- |
【注】：*Ligation Enhancer比较粘稠，使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
三、连接产物磁珠纯化 (Post Ligation Clean Up)
该步骤使用磁珠对接头连接产物进行纯化。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。
本次采用接头连接后先纯化再分选方案，连接产物先进行0.6×纯化，102 μL ddH2O洗脱后再按0.65×/0.15×比例分选，最终洗脱产物20 μL进行下一步扩增反应。
三、文库扩增 (Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。参考表3进行文库扩增反应体系配制和程序设置。
表3. 文库扩增反应
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名称 |
体积 (μL) |
温度 |
时间 |
循环数 |
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Adapter Ligated DNA |
20 |
98℃ |
45 sec |
1 |
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2×Ultima HF Amplification Mix |
25 |
98℃ |
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7 |
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Primer Mix（12330ES） |
5* |
60℃ |
30 sec |
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Total |
50 |
72℃ |
30 sec |
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|
- |
- |
72℃ |
1 min |
1 |
|
- |
- |
4℃ |
Hold |
- |
四、扩增产物磁珠纯化
扩增后产物使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)纯化。
质检结果
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实验编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
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物种 |
大刺鳅 |
大刺鳅 |
大刺鳅 |
牡蛎 |
牡蛎 |
牡蛎 |
扇贝 |
扇贝 |
扇贝 |
小龙虾 |
小龙虾 |
小龙虾 |
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文库浓度（ng/μL） |
30.4 |
30.4 |
58.4 |
63.6 |
88.8 |
48.4 |
52.6 |
43.5 |
54.7 |
48.9 |
47.4 |
48.6 |
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文库产量(ng) |
699 |
699 |
1343 |
1463 |
2042 |
1113 |
1210 |
1001 |
1258 |
1125 |
1090 |
1118 |
文库琼脂糖凝胶电泳图（Marker 最亮的条带为500 bp）
Qsep分析图（取1~4号样本进行Qsep分析）
实验结果分析
水产样本大刺鳅、牡蛎、扇贝、小龙虾采用酶切法建库试剂盒12972ES在AMTK ilab300建库，文库产量高，文库片段集中，满足质控标准。
