肾脏是人体中重要器官之一，具有清除代谢废物，维持电解质平衡等生理功能，保证机体内环境的稳定。肾脏类器官(kidney organoid)是肾脏功能的3D模型，有利于人类肾脏疾病的建模，大多由多能人类干细胞(PSC)在体外经诱导生成，能够表达出和人肾单位相似的各类结构，如肾小球足细胞、近端小管、远端小管、集合管等。

我们根据Nat Protoc.^[1]发表的文章，整理了人类多能干细胞生成肾脏类器官的培养方案。

 图1.hPSC分化为肾脏类器官的过程(PMID: 28005067)^[1]

hPSC接种到包被了无LDEV低生长因子基底膜基质的6孔板上，用ReproFF2培养基（含有10 ng/mL FGF2）培养。健康的未分化hPSC显示出边界清晰的圆形集落形态，使用iPS细胞的解离溶液分离健康的未分化hPSC，每七天传代。

当细胞密度达到80%时，使用Accutase消化细胞，用ReproFF2培养基(含10 μM Y27632)重悬，接种到包被了无LDEV低生长因子基底膜基质的24孔板上，培养3天，更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，3~10 μM CHIR99021，5-25 ng/mL Noggin，100-500 nM Dorsomorphin）继续培养，每两天换液，直至细胞形态为松散形成的密集细胞团（一般需要96 h）。然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL activin A）继续培养2-3天。 

更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9）继续培养2天。

图2.hPSC分化过程中的形态变化(PMID: 28005067)^[1]

Day 0，分化开始时未分化的hPSC (H9)；Day 4，晚期原始条纹阶段；Day 9，肾单位祖细胞期. Day 14，肾囊泡期；Day 21，肾单位期；在第4天进行激活素A处理的细胞的最佳形态是可见松散密集的簇。

4.1 NPC向肾脏类器官的分化(2D)

步骤3后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9，3 μM CHIR99021）继续培养2天；然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9）培养2-3天，如果观察到类似肾小泡的带有管腔的圆极化结构，则继续下一步。如果在3天内未观察到肾泡结构，则通过免疫染色确认LHX1是否表达；然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX）培养，每2-3天换液，肾脏类器官在至少长达3个月的分化中是稳定的，肾单位结构可以用显微镜识别。

4.2 hPSC向肾脏类器官的分化(3D)

步骤2后使用Accutase消化细胞，用Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9，3 μM CHIR99021）重悬后接种于超低吸附的圆底96孔板中，培养2天，然后更换为Advanced RPMI 1640培养基（含有1× L-GlutaMAX，10 ng/mL FGF9）继续培养2-3天，直到显微镜观察到肾泡状圆形结构。

图3.NPC和肾单位的免疫染色(PMID: 28005067)^[1]

(a)分化第9天SIX2的免疫荧光显示NPC。比例尺：50 μm；(b)免疫荧光染色鉴别分化2D培养中第21天的肾单位结构。比例尺：50 μm；(c) 在3D培养中分化的第21天用冷冻切片识别肾单位结构，比例尺：50 μm；(d) 3D培养中第28天（左，比例尺：50 μm）和第21天（右，比例尺100 μm）肾单位的免疫染色，PODXL：一种足细胞标记物，LTL：一种近端小管标记物，CDH1：Henle环和远端小管标记物；(e)3D培养中第21天类器官的明场图像，箭头表示肾小球结构。

[1] Morizane R, et al. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 2017 Jan;12(1):195-207.

[2] Little MH, et al. Generating Kidney from Stem Cells. Annu Rev Physiol. 2019 Feb 10;81:335-357.