RNase活性检测试剂盒（荧光标记法）使用一种新型RNA底物，其一端标记有荧光报告基团分子(Fluor)，另一端标记有淬灭基团。在不存在RNase时，淬灭基团的物理接近会将荧光报告基团中的荧光淬灭到极低水平。当有RNase时，RNA底物被水解，荧光报告基团和淬灭基团在溶液中的空间上发生分离，这导致Fluor在被适当波长的光激发时发出明亮的荧光，该荧光可以通过多功能酶标仪（含荧光模块）和基于滤光片或单色器的荧光计进行检测。

RNase活性检测试剂盒（荧光标记法）采用底物荧光标记法，可定量或定性的检测单个样品中的RNase，从而判断样本是否有RNase污染。

 

产品信息

货号	41309ES96 / 41309ES97
规格	1×96 T / 5×96 T

 

组分信息

组分编号	组分名称	41309ES96	41309ES97
41309-A	RNase Substrate	1 tube	5×1 tube
41309-B	10×RNase buffer	1 mL	5 mL
41309-C	RNase A (≈1×10-4 U/μL)	100 μL	500 μL
41309-D	DEPC-treated Water	10 mL	50 mL
41309-E	Surface RNase Remover	50 mL	250 mL

 

运输和储存条件

1. 所有组分均干冰运输，有效期1年。

2. 收到货后，请先检查共5个组分是否齐全，再将41309-E组分2-8℃保存，其它组分-25~-15℃保存，避免反复冻融。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

5. 加样和配液步骤请严格在冰上操作，以减缓上机前酶对底物的消耗。

6. 实验需使用低吸附耗材以降低酶损耗。

7. 定量实验需使用黑色酶标板以最大程度减少本底荧光。

 

使用说明

1. 适用机型

包含但不限于以下仪器：

Thermo Scientific: Invitrogen Qubit 4;

Molecular Devices: SpectraMax M3.

2. 实验前准备

1）在整个实验开始前，请先使用试剂盒中的Surface RNase Remover对实验环境进行处理（可稀释10倍进行喷洒或擦拭，具体可参考翌圣10609ES60使用说明书），以降低RNase污染。

2）本品可对具备活性的RNase进行检测及估值，在实验过程中可根据实际情况选择定性检测或者定量检测方法。

3. 定性检测方法

使用终点法在荧光仪或酶标仪上对待测样本进行读数，以Thermo公司Invitrogen Qubit 4荧光仪为例：

1）溶解RNase Substrate：取1管RNase Substrate干粉，高速离心，缓慢打开瓶盖加入1 mL DEPC-treated Water备用。

2）配制反应体系：每次实验均需制备阴性对照、阳性对照和待测样本体系。具体操作如下（按顺序加入下列试剂并混匀）：

阴性对照反应体系	体积(μL)
DEPC-treated Water	160
10×RNase buffer	20
RNase Substrate	20
总体积	200

表1 阴性对照反应体系

阳性对照反应体系	体积(μL)
DEPC-treated Water	140
10×RNase buffer	20
RNase Substrate	20
5 pg/μL RNase A*	20
总体积	200

表2 阳性对照反应体系

^*试剂盒C组分的RNase A参考品稀释20倍约为5 pg/μL的RNase A。

待测样本反应体系	体积(μL)
DEPC-treated Water	140
10×RNase buffer	20
RNase Substrate	20
待测样本	20
总体积	200

表3 待测样本反应体系

^*若待测样本污染较轻可增加待测样本体积，最大可增加至160 μL，相应减少DEPC-treated Water添加量，最小可减少至0，保持总体积不变。

3）检测初始荧光值：以Qubit4为例，对阴性对照、阳性对照和待测样本进行检测，选择“Fluorometer”进入荧光检测界面后，再选择“Blue”进行检测，并记录初始荧光值“RFU₀”。

4）37℃孵育读值：将阴性对照、阳性对照和待测样本均放入37℃恒温箱孵育60 min后，重复步骤3，记录终末荧光值“RFU₆₀”。5）结果判读：若阴性对照荧光值孵育前后变化不超过50%，阳性对照RFU₆₀远大于2RFU₀，且待测样本RFU₆₀≥2RFU₀，则判定待测样本被RNase污染。

4. 定量检测方法

使用多功能酶标仪对RNase进行实时监测并定量，使用此方法可以获得RNase消化底物的实时曲线。以Molecular Devices公司SpectraMax M3多功能酶标仪为例：

1）溶解RNase Substrate^*：取1管RNase Substrate干粉，高速离心，缓慢打开瓶盖加入1 mL DEPC-treated Water备用，该干粉加入DEPC水后，可分装置于-25~-15℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。

2）稀释RNase A^**：对试剂盒中RNase A梯度稀释，浓度依次为5 pg/μL、2.5 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL。操作如下：

a. 取1.5 mL洁净离心管，加入495 μL DEPC-treated Water，再加入5 μL 10×RNase buffer，即获得500 μL 0.1×RNase buffer，用于后续配置梯度稀释液，配置前请将溶液轻微振荡混匀。

b. 取5支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4。

c. 在标记为Std0^***的1.5 mL离心管中加入45 μL 0.1×RNase buffer和5 μL试剂盒中提供的RNase A(≈1×10^-4 U/μL)，即稀释为10 pg/μL（≈1×10^-5 U/μL）的RNase A。

d. 在Std1、Std2、Std3、Std4管中先分别加入下表所示体积的0.1×RNase buffer，再进行梯度稀释，具体稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
Std1	30μL Std0 + 30μL 0.1×RNase buffer	5 pg/μL
Std2	30μL Std1 + 30μL 0.1×RNase buffer	2.5 pg/μL
Std3	20μL Std2 + 30μL 0.1×RNase buffer	1 pg/μL
Std4	5μL Std3 + 45μL 0.1×RNase buffer	0.1 pg/μL

表4 标准品梯度稀释

^*为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将稀释好的RNase Substrate分装储存于-25~-15℃。

^**已知试剂盒中的RNase A浓度为≈1×10^-4 U/μL，且对于RNase A的单位U和pg的换算关系为5×10^-7 U≈0.5pg。

^***Std0配制：将试剂盒中RNase A由1×10^-4 U/μL稀释至1×10^-5 U/μL，因5×10^-7 U≈0.5pg，则1×10^-5 U≈10pg，故1×10^-5 U/μL≈10pg/μL。

3）标准品和待测样本的反应体系配制：

a. 标准品和阴性对照的Mix混合液配制：通常包括4个浓度梯度的RNase A参考品标准曲线和1个无模板对照NTC共5个样本，每个样本2个重复孔，再加1孔的损失量，共计11个孔。具体操作如下（按顺序加入下列试剂并混匀）：

Mix混合液	体积(μL)
DEPC-treated Water	770 （11*70）
10×RNase buffer	110 （11*10）
RNase Substrate	110 （11*10）
总体积	990 （11*90）

表5 Mix混合液配制体系

标准品和阴性对照反应体系配制：将上述配制的Mix混合液以90 μL/孔进行分装，再添加10 μL/孔稀释好的RNase A参考品或10 μL/孔的阴性对照（可用0.1×RNase buffer作为阴性对照）。具体操作如下：

标准品反应体系	体积(μL)
DEPC-treated Water	70
10×RNase buffer	10
RNase Substrate	10
RNase A参考品梯度稀释液	10
总体积	100

表6 标准品反应体系

阴性对照反应体系	体积(μL)
DEPC-treated Water	70
10×RNase buffer	10
RNase Substrate	10
0.1×RNase buffer	10
总体积	100

表7 阴性对照反应体系

b. 待测样本反应体系配制（按顺序加入下列试剂并混匀）：

待测样本反应体系	体积(μL)
DEPC-treated Water	70
10×RNase buffer	10
RNase Substrate	10
待测样本*	10
总体积	100

表8 待测样本反应体系

^*若待测样本污染较轻可增加待测样本体积，最大可增加至80 μL（待测样本的本底检测与之保持一致），相应的减少DEPC-treated Water添加量，最小可减少至0，保持反应体系总体积不变。

c. 待测样本的本底检测反应体系配制：

待测样本的本底反应体系*	体积(μL)
DEPC-treated Water	90
待测样本**	10
总体积***	100

表9 待测样本的本底反应体系

^*建议每次进行RNase活性检测时，针对每个初次测试的待测样本都增加不含RNase Substrate的本底荧光检测，若本底荧光偏高则计算时应减去。

^**每次进行RNase活性检测实验时，标准品、阴性对照、待测样本、待测样本的本底检测等都至少做2个重复孔。

^***为确保检测的准确性，所有样本进行加样时，请务必在冰上操作。

4）下表为参考板位：

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

标准曲线Std1

标准曲线Std1

待测样本TS1

待测样本TS1

TS1本底检测

TS1本底检测

B

标准曲线Std2

标准曲线Std2

待测样本TS2

待测样本TS2

TS2本底检测

TS2本底检测

C

标准曲线Std3

标准曲线Std3

待测样本TS3

待测样本TS3

TS3本底检测

TS3本底检测

D

标准曲线Std4

标准曲线Std4

待测样本TS4

待测样本TS4

TS4本底检测

TS4本底检测

E

待测样本TS5

待测样本TS5

TS5本底检测

TS5本底检测

F

待测样本TS6

待测样本TS6

TS6本底检测

TS6本底检测

G

待测样本TS7

待测样本TS7

TS7本底检测

TS7本底检测

H

NTC

NTC

待测样本TS8

待测样本TS8

TS8本底检测

TS8本底检测

表10 上机参考板位

该示例是对RNase活性检测的荧光标记法的操作展示，检测样本包括：4个浓度梯度的RNase A标准曲线、1个无模板对照NTC、8个待测样本TS、8个待测样本对应的本底检测。建议每个样本做2个重复孔。

5）仪器设置：使用酶标仪进行本实验，选择96孔板动力学模式以及荧光检测模块，选择中等增益，设置激发光490 nm，发射光520 nm；以1 min间隔读取数据，37℃恒温连续读数1 h（视待测物污染情况而定），此方法可实时监控体系动态。

6）结果判读：

a. 若RFU₆₀≥2RFU₀，则判定待测样本被RNase污染。

b. 若判定样本已污染，则制作标准曲线检测待测样本RNase污染含量（以下示例显示总体系的污染含量，如：标准品5 pg/μL，加样量10 μL，即总体系含量50 pg）：

c. 以标准品开始读数时的前几分钟（可从时间曲线上判断线性增长期并选择合适的时间点，如下图一般选择0-3 min）所得数据制作标准曲线，再结合标准曲线和待测样本在此时间点的荧光值可得其RNase污染的估值，也可通过实时荧光曲线趋势判断待测样本中RNase的污染情况。

图1 RNase活性检测试剂盒动力曲线

d. 示例：已知待测样本的RFU₆₀≥2RFU₀，选择2 min时标准品各稀释梯度对应的RFU制作标准曲线（如下图），将待测样本2 min时的RFU值代入标曲公式，即得待测样本整体的RNase活性浓度。

图表2 2min时的标准曲线

   【注】：

1. 该试剂盒测定的是待测样本体系整体的RNase活性残留。
2. 试剂盒利用RNase对底物特异性切割的特性进行检测，因此具有使蛋白质变性及含有使RNA单链断裂的物质不适用此试剂盒。
3. 深色液体会对荧光收集产生影响，可能会影响结果准确性。
4. 部分待测样本由于过酸、过碱或盐离子浓度过高抑制RNase的活性，可视情况对待测样本进行稀释后检测。
5. 在使用定量方法检测时，仪器有时初始荧光值会虚高，请观察时间曲线选择最低荧光值作为RFU₀进行污染判断。

 

Ver.CN20230816