2020年，疫情席卷全球，分子诊断技术站了在世界的舞台中央。荧光PCR法作为新 冠病毒核酸检测的金标准，为新 冠病毒的检测提供了有力保障。然而，检测结果不准确、假阳性和假阴性等问题，也一度让分子诊断技术备受争议。深究原因排除人为操作因素外，归根结底要考虑试剂盒的质量问题。而新 冠检测过程中的核心成分--扩增模块中的热启动酶，无疑是其中关键的一环。

市面上诊断试剂盒扩增模块中的酶基本上都是抗体法热启动酶，但实际样本检测中不同厂家的酶原料差异又很大。那为何选择抗体法热启动酶作为IVD核心酶，其质量如何评测，又如何筛选出高质量的抗体法热启动酶?

热启动酶在IVD领域应用较为广泛，很好的解决了常规型PCR技术因产生引物二聚体或错配引起的非特异性扩增等问题，大大提高了反应的特异性，从而实现精准检测。目前市面上常见的热启动酶按热启动修饰方法主要分为化学法、配体法和抗体法等。这三种方法在原理上有所区别，也各有优劣势（见表1）。

表1. 热启动酶常见修饰方法优劣势比较

相比较而言，化学修饰物不能够批量合成，而且需要较长的激活时间DNA聚合酶才能释放酶活；配体修饰DNA聚合酶只在20-25°C效果较好，到40°C时，聚合酶的活性就被释放出来，即酶活封闭效果不稳定，特异性不好；而抗体修饰的热启动酶可以达到很好的封闭酶活的效果，即对应的封闭效果最佳，且酶活释放速度快，能大大降低PCR的反应时间，因此是目前IVD市场上应用最多的DNA聚合酶热启动改造方法。

Taq酶的酶活、扩增效率、灵敏度、抗体封闭效果等都是抗体法热启动酶的主要评测指标。
 

Taq酶活测定目前在分子诊断行业没有固定的标准，不同厂家酶活标定的方法不同，导致客户使用中会出现较大的问题。一般测试方法是同位素的方法进行测定。这种方法具有高灵敏性，但只能检测聚合酶活性，有时候并不能反映出实际TaqMan探针的扩增效果。TaqMan探针法qPCR除了需要Taq酶5'→3'聚合酶活性外，还需要检测Taq酶的5'→3'外切酶活性。这就是常规Taq酶活性测定的缺陷。建议大家购买了特定公司的Taq酶之后需要用自己设计的引物探针进行实际酶活的二次标定，以减少应用中的不确定性。翌圣生物除了做Taq酶5'→3'聚合酶活性检测之外，还利用TaqMan的方法进行5'→3'外切酶活性的标定，减少了客户实际应用中的问题。

PCR反应的扩增效率与DNA聚合酶的性能密切相关。通常验证扩增效率是将模板稀释成一系列浓度梯度进行qPCR反应，用模板初始量（或未知量样品的稀释倍数）的log值对每个稀释样品的Ct值，做标准曲线图，得到斜率和R²值，扩增效率通过公式E=10^-1/斜率^-1计算，若介于90~110%，表示扩增正常。若＜90%，则可能qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当。

扩增效率与酶的比活性有较大的关系。酶的纯度越高，比活性相对就高，这样可以减少非活性Taq酶与底物的结合，提高有效扩增几率。

Taq酶的灵敏度和很多方面都有很大的关系，除了上面提到的酶纯度，还有一个方面是Taq酶和底物的亲和性，如果亲和性越高，灵敏度自然就会比较高。相比底物亲和性较低的Taq酶就需要通过提高酶浓度，即增加单次反应中的Taq酶的分子数来达到提高灵敏度的目的。这时试剂成本就会提高很多。翌圣生物通过筛选高亲和性Taq突变体，保障了个位拷贝数检出的灵敏度。

热启动Taq酶是提高PCR扩增灵敏度和特异性的重要的因素之一。非热启动的Taq酶由于在试剂配制过程中，会有一定的活性，容易导致非特异性扩增，最终会导致灵敏度的降低。一个活性有效封闭的Taq酶对于qPCR的有效扩增至关重要。翌圣生物通过高通量筛选抗体，获得了高亲和，易释放的抗体，并开发了相关的检测方法，保障了热启动Taq酶的高品质。

1. 熔解曲线测定性法

设置非热启动组、抗体封闭组、和无聚合酶对照组，将模板和引物对加入SYBR Green染料法qPCR的反应体系中，37℃孵育40 min，分别检测熔解曲线。非热启动组显示出有扩增产物生产，而另外两组是引物二聚体，没有产物形成。这说明抗体封闭效果明显。

图1. Taq Antibody封闭效果熔解曲线

2. 荧光值定量法

一般通过对比非热启动组、抗体封闭组和无聚合酶对照组的荧光值高低判断封闭效果。在50℃ 条件下进行延伸，反应后取产物，加入适量PicoGreen染色液染色混匀后，进行荧光信号检测。根据荧光值判断热启动酶活封闭效果，进一步计算封闭效率，一般认为封闭效率大于90%即认为封闭效果良好。

表2. 热启动酶抗体封闭效率检测

备注：封闭效率=100% -（样本荧光值-阴性荧光值）/（阳性荧光值-阴性荧光值）

生产合格的IVD试剂，一般是在原料控制、生产管理、质检管控和仓储运输等几个环节严格把控，层层把关。而抗体法热启动酶作为IVD试剂的核心原料，生产高质量的抗体法热启动酶主要考虑其中两个核心组分：封闭用抗体和DNA聚合酶。因此在原料把控、生产管理、质检管控和仓储运输等方面也需要慎之又慎。

产品质量控制严格遵循“三重防护”：中间原料质检，成品自检留样、成品抽检管控。抗体法热启动酶生产后的质控环节，主要在核酸酶残留检测、大肠杆菌检测、DNA扩增能力测试和抗体法热启动酶酶活封闭效果检测等方面，同时在不同批次的稳定性把控方面坚持质量问题“零容忍”。

遵循模块化仓储，冷链运输原则。
 

翌圣生物作为长期专注于分子酶原料及建库试剂盒等产品研发和生产的国家高新技术企业，依托长期储备的分子酶双向改造技术、蛋白发酵纯化技术和高效抗体筛选技术平台，翌圣生物酶原料可应用于IVD分子诊断、治疗领域。

不仅可提供抗体法热启动酶和封闭用Taq酶抗体和Taq酶5'→3'外切酶单克隆抗体，也可提供包括RT-PCR检测试剂盒组装用的核心试剂和所需的一系列关键分子酶原料，包括抗体法Taq酶、反转录酶、RNase抑制剂和UDG酶/dUTP等。

HB210617