NGS入门3：植物叶片样本的ATAC建库，需要哪些试剂、仪器以及实验步骤

ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）是一种用于全基因组范围内解析染色质可及性的高通量测序技术。该技术通过高活性的Tn5转座酶特异性识别并切割染色质中结构疏松的开放区域，在切割DNA片段的同时直接连接测序接头，经文库扩增后上机测序，从而精确定位基因组中的开放染色质区域（如启动子、增强子等转录调控元件的位置）。

简单来说，ATAC-seq通过Tn5转座酶介导的"切割+连接"反应，直接将带有测序接头的DNA序列插入到染色质的开放区域，随后通过PCR扩增获得可供测序的文库。与传统染色质开放性检测方法DNase-seq和MNase-seq相比，ATAC-seq具有样本需求量少、操作步骤简单、实验周期短（数小时内完成建库）等显著优势。

图1 ATAC原理图（图片来源：网，侵删）

ATAC-seq在植物研究中的应用正快速增长。根据GEO和PubMed数据库的统计，植物相关的ATAC-seq研究已覆盖拟南芥、水稻、玉米、番茄、苹果、辣椒、柑橘、结缕草等多个物种，涉及发育调控、非生物胁迫响应、次生代谢、果实品质形成等多个研究方向。

在非生物胁迫响应研究中，ATAC-seq可揭示胁迫条件下染色质开放区域的动态变化，识别关键的转录因子结合位点。例如，在番茄耐寒性研究中，研究团队对对照和冷胁迫处理的番茄叶片进行ATAC-seq，发现转录因子WRKY34的染色质可及性和基因表达在低温胁迫下均发生显著变化，其启动子区域的60 bp插入缺失（InDel）包含一个GATA顺式调控元件，该元件的存在与否直接影响了番茄的耐寒性。在结缕草干旱胁迫研究中，通过整合ATAC-seq和RNA-seq多组学技术，发现ATAC-seq峰强度与基因表达水平呈正相关，共鉴定出63个干旱相关高置信度基因。

在发育与果实品质研究中，ATAC-seq可用于解析果实发育进程中染色质可及性的动态变化。南京农业大学团队对栽培番茄从开花前7天至授粉后10天共6个关键发育阶段的果实进行ATAC-seq，发现超过60%的基因座位含有多个可及染色质区域（cis-ACRs），这些区域在不同发育阶段呈现同步或非同步的变化趋势，与相关基因的表达趋势存在一致性。研究发现栽培番茄特有的cis-ACRs类群中近20%与结构变异（SV）重叠，MBP3内含子中cis-ACR的敲除导致果重降低、果形变长且可溶性固形物含量增加。

植物叶片样本ATAC的技术挑战：与动物细胞相比，植物ATAC面临一些独特挑战：植物叶片组织具有细胞壁、胞间连丝、次生代谢物，并富含叶绿体等细胞器，这些结构成分增加了细胞核提取的难度。提取过程中若细胞核膜受损、细胞器残留过多或杂质干扰严重，将直接影响Tn5转座酶的切割效率以及后续文库构建质量。

植物叶片ATAC-seq的整体流程可归纳为四个核心环节：植物叶片取样与前处理 → 细胞核提取与纯化 → 文库构建与纯化 → 文库质控与测序。

核提取液缓冲液 A：10 mM Tris pH 8.0、10 mM KCl、0.5 mM spermidine。 

核提取液缓冲液 B：0.25 M 蔗糖、10 mM Tris pH 8.0、10 mM MgCl2、1% Triton X-100、5 mM β-巯基乙醇、0.1% Protease Inhibitor Cocktail。

核提取液缓冲液 C：1.8 M 蔗糖、10 mM Tris pH 8.0、2 mM MgCl2、0.15% Triton X-100、5 mM β-巯基乙醇、0.1% Protease Inhibitor Cocktail。

核提取液缓冲液 D：10 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、0.5 mM spermidine、0.1%  Protease Inhibitor Cocktail。

原理与要点：植物叶片样本的初始状态直接影响后续细胞核提取的质量。叶片组织中丰富的叶绿体、多糖多酚以及细胞壁的物理屏障需要通过适当的物理和酶学方法破除。

称取 0.2 g 新鲜植物组织（如叶片等），用剪刀将样品剪成碎片后置于 5 cm 塑料培养皿中，加入核提取缓冲液A（不能加太多缓冲液，刚刚能浸湿样品即可），用刀片轻而快的切样品直至样品看不见颗粒为止（泥状或卵状)（若样本冻存时间较长，需要进行液氮研磨，即称取 0.2 g 冻存样本，加入液氮充分研磨成冻干粉末，将研磨好的粉末用6 mL 预冷的核提取液 A 重悬并转移至 15 mL 离心管中，颠倒震荡混匀）。

高质量的细胞核是ATAC-seq成功的前提。细胞核提取的关键在于：

①使用温和的去垢剂刚好裂解细胞膜而保持核膜完整；②通过多次离心和密度梯度离心去除细胞器及碎片杂质；③全程低温操作维持细胞核的稳定性。

用 40 μm 滤器（建议尽量用能适配 15 mL EP 管的滤器，过大会造成样品损失）过滤步骤3.1 中的溶液，步骤3.1培养皿中有剩余样品可以吸取核提取缓冲液 A 少量多次冲洗并将冲洗液继续过滤。 

流式分选（可选）：有流式分选条件的，用 DAPI 对核悬液进行染色后，流式分选细胞核，之后按照建库流程开始进行实验。 

不能进行流式分选时，将过滤后的样品 4℃ 12000 × g 离心 5 min，吸净管内液体。若过滤后的样品有很多色素，用1 mL 核酸提取液B重悬后，4℃ 12000 × g 离心 5 min，重复多次，直至无色素或色素颜色较弱。

 用核酸提取液C重悬离心后的沉淀。 另取一个新的 1.5 mL EP管，在EP管中加入 500 μL 核酸提取液C。 将重悬液沿着EP管管壁缓缓加入，使悬液置于500 μL 核酸提取液C上方，避免两步骤中溶液混合。 4℃ 12000 × g 离心 45 min。 弃上清，加入 1 mL 核提取缓冲液D重悬沉淀后，4℃ 2000 × g 离心 5 min，去掉上清。重复三次后，取100-100,000个细胞核用于后续ATAC文库构建。

【注】*：收集的细胞核在实验前，建议用台盼蓝染色（40207ES或40208ES）进行细胞核完整性鉴定，细胞核完整性不低于 80%，细胞核完整性过低，容易导致背景噪音。

文库构建以翌圣生物ATAC建库试剂盒（12208ES）为例，简要介绍建库流程。

提前配制Transposition Mix，冰上预冷。将配制好的Transposition Mix加入到处理后的细胞核中（已根据实验需要进行细胞核计数），使用移液器轻轻吹打 5-8 次混匀。将上述 PCR 管置于 PCR 仪中，设置反应程序（热盖 55℃；37℃ 30min；4℃ hold），进行片段化反应。将反应结束后的 PCR 管瞬离，立即向每个样本中加入 5 μL 的 Terminate Solution，用移液器轻柔吹打20 次混匀，室温静置 5 min。

将平衡至室温的 DNA Extract Beads 磁珠，涡旋振荡混匀。吸取 130 μL DNA Extract Beads 至 55 μL 终止后的片段化产物中进行基因组DNA纯化，最终入 25 μL ddH2O洗脱。

将纯化后的DNA加入PCR反应体系中（含高保真DNA聚合酶和Index引物），按设定程序进行扩增。循环数可参考推荐循环数或通过预实验优化，避免循环过多导致文库复杂度下降。

由于起始细胞量以及不同种类细胞的染色质开放状态差异，文库大小可能存在不同的分布模式。通过磁珠分选，文库中的大片段可以有效去除，使得文库片段分布在 200-700 bp 左右。进行双轮分选的比例推荐0.55×/1.0×，最终21 μL ddH2O洗脱终文库。

使用Qubit dsDNA HS Assay Kit精确定量文库浓度。

使用Agilent 2100 Bioanalyzer或等效设备评估文库片段分布。高质量ATAC文库应在约150-600 bp范围内呈现清晰的周期性峰（对应单核小体、二核小体、三核小体等）。若出现严重的引物二聚体峰（<100 bp）或大片段非特异性扩增产物，需重新纯化或重新建库。

将质检合格的文库混合后上机测序，推荐测序策略为Illumina平台PE150模式。

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