WB实验指南：封闭操作指南及注意事项

2026-10-21

蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）是一种常用于蛋白质分析的技术手段，其核心流程包括通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品进行分离，随后将蛋白转移至固相膜上，并利用特异性抗体（通常为一抗与二抗的复合物）对目标蛋白进行检测。该方法因其高灵敏度和良好的特异性，已成为生命科学研究中应用最广泛的蛋白检测技术之一。

蛋白封闭是将转膜后固相膜上未被蛋白质占据的空白位点进行饱和处理的关键步骤，通过封闭液占据膜上的非特异性结合位点，为后续的抗体孵育做准备，可有效减少抗体与膜的非特异性结合、降低背景信号。本文对封闭步骤涉及到的操作步骤、试剂选择及常见问题进行详细介绍。

封闭液的选择

封闭液的选择需要综合考虑多个因素，包括抗体相容性、目标蛋白的相容性、检测系统以及成本等。常见的封闭液有以下几种：

脱脂奶粉：是最常用和最便宜的封闭剂，通常使用2.5%~5%的溶液。然而，如果目标蛋白被磷酸化，则不应使用牛奶，因为牛奶中的酪蛋白会与抗磷酸化抗体结合，导致非特异性结合和高背景。

牛血清白蛋白(BSA)：从牛血清中纯化的白蛋白，使用浓度为2%~5%。BSA纯度较高，不容易产生非特异性结合，适合于对背景要求严格的实验。同时，BSA可用于检测磷酸化蛋白。但需要注意的是，BSA制剂含有磷酸化酪氨酸，可能会引起抗磷酸酪氨酸抗体的高背景。

鱼明胶：更常用于免疫组化，但也可用于Western blot实验，使用浓度为0.1%~5%。鱼明胶不会与哺乳动物抗体发生交叉反应，因为它不含哺乳动物血清蛋白。但需要注意的是，不要将鱼明胶与亲和素-生物素检测系统一起使用，因为它含有内源性生物素。

正常血清：如牛、兔、山羊、小鼠等动物的正常血清，使用浓度为5%~10%。正常血清携带免疫球蛋白，这些免疫球蛋白可以与膜上的反应性位点结合，从而阻止标记的IgG抗体的非特异性结合。但正常血清价格较高，且通常以较高的浓度使用。

快速封闭液：是一种不含血清和生物素的单一纯化蛋白封闭液。它在多种抗体和抗体组合中性能良好，与链霉亲和素系统兼容，且封闭速度快，通常15分钟内即可完成封闭。适用于需要剥离和再次检测印迹的蛋白。

货号	36122ES	36128ES	36120ES	36101ES	36116ES
名称	快速封闭液	无蛋白快速封闭液	脱脂奶粉	牛血清白蛋白，标准级	正常驴血清
规格	100 mL/500 mL	100 mL/500 mL	100 g/500 g	25 g/50 g/100 g/500 g/1 kg	1 mL/10 mL
优点	不含哺乳动物来源的蛋白成分，干扰少，背景低，封闭仅需10 min	无蛋白配方，与抗体无交叉反应干扰少，信噪比高10 min快速完成封闭	质量稳定，性价比高	质量稳定，性价比高	经脂质萃取和透析后储存于缓冲液，降低染色背景和假阳性
主要用途	WB	WB	WB、ELISA	WB、ELISA	IHC、IF

实验方法

清洗：取出膜，用蒸馏水，再用TBST清洗膜2~3次，每次5 min。

将膜置于25 mL封闭缓冲液中，在室温下利用摇床孵育1小时或使用快速封闭液处理10~15 min完成封闭。

用5 mL TBST洗涤三次，每次15 min。

货号	名称	规格
60145ES	10× TBST缓冲液	500 mL/2× 500 mL
80470ES	PucEuip® 数显轨道摇床	1台
80471ES	数显翘板摇床	1台
84612ES	Western抗体孵育盒，单格	10个/包
84614ES	Western抗体孵育盒，5格	10个/包

注意事项

1. 没有任何一种封闭剂能适合所有抗原和抗体的检测系统。如出现本试剂不适合的抗体，请替换使用其它种类的封闭剂如BSA或脱脂奶粉等。

2.做免疫组化和免疫荧光实验建议用血清封闭。

3.某些抗体使用BSA封闭可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，具体需阅读说明书。

4.以下情况不用脱脂奶粉：生物素化标记的抗体、磷酸化抗体检测蛋白磷酸化、碱性磷酸酶（AP）显色方法

5.背景高：有可能是抗体使用量过多；膜洗涤时间不足；抗体和封闭液发生交叉反应；试剂或仪器设备被污染等原因造成，需要根据实验具体情况进行调整。

6. 背景有不均匀的黑色斑点：封闭液未完全溶解，使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点；或抗体在膜上分布不均。封闭液一定要充分溶解，封闭结束之后要用 TBST 清洗三遍再加一抗；抗体孵育时保持摇动。

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操作视频详见：Western Blot蛋白免疫印迹实验攻略