热敏蛋白酶 K: 55℃ 10 min灭活，告别分子实验繁琐纯化步骤

2026-09-24

蛋白酶 K（Proteinase K）自20世纪70年代从白色侧齿霉菌中分离以来，凭借其广谱的蛋白水解活性与优异抗自消化能力，已成为分子生物学领域不可或缺的工具酶，广泛应用于核酸提取、组织消化、杂蛋白去除及酶反应终止等场景。

然而，传统Proteinase K的"灭活难题"长期制约着实验效率与数据质量：

高温灭活损伤样本：常规方案需65–95℃加热灭活，高温极易破坏长片段DNA、RNA及甲基化修饰等热敏感靶标；

残留酶持续干扰：若灭活不彻底，残留的Proteinase K会降解下游体系中的Taq酶、逆转录酶、抗体等关键组分，导致PCR抑制、建库失败或数据失真；

纯化步骤繁琐耗时：为消除残留酶活，实验往往需额外进行磁珠/柱式纯化或有机抽提，不仅拉长流程，更造成微量样本的不可逆损耗。

翌圣生物通过酶进化技术改造获得Thermolabile Proteinase K（Cat#14809ES）。该酶在20–40℃、pH 7.0–9.5范围内保持与野生型相当的广谱切割活性，而其核心优势在于：仅需55℃孵育10 min即可实现热失活，无需额外纯化步骤即可彻底消除酶残留干扰，真正实现"消化-灭活-下游反应"的一管式工作流。

表1 普通Proteinase K vs Thermolabile Proteinase K 核心参数对比

产品名称	Proteinase K	Thermolabile Proteinase K
反应条件	在20-60℃、pH在7.5-12.0	在20-40℃和pH7.0-9.5
灭活条件	95°C，10 min	55°C，10 min
优势	来源广泛，成本较低；适用于常规核酸提取与组织消化	① 完全热灭活，零残留干扰下游反应② 低温反应，保护热敏感样本完整性③ 支持一管式反应，免纯化直扩
局限性	灭活温度高，易破坏样本中关键组分	重组突变体，成本相对较高

应用场景解析

◆ 单细胞与空间表观组学（CUT&Tag）

图1. Proteinase K在CUT&Tag 实验中工作流程图^[11]

痛点：在CUT&Tag实验中，pA/G-Tn5转座体完成原位切割与接头插入后，体系内残留的Tn5转座酶、抗体及pA/G融合蛋白若去除不完全，会竞争性结合DNA片段，抑制后续PCR扩增，导致文库产量低、背景信号高，甚至建库失败。传统方案在Proteinase K消化后必须进行磁珠纯化，操作繁琐且微量样本损耗严重。

解决方案：使用翌圣Thermolabile Proteinase K于37℃充分消化体系内各类蛋白，释放转座片段；随后55℃ 10 min彻底灭活，无需磁珠纯化即可在同一反应管中直接加入条形码引物与PCR预混液进行扩增。该流程完美适配单细胞低起始量样本，同时兼容高通量自动化平台，可稳定产出高质量表观测序文库。^[1][11]

◆ 靶向长读长测序建库

图2. CTM-nSeq工作流程^[5]

痛点：在基于Cas9/Cas12a RNP的靶向长读长测序（LRS）中，RNP完成靶位点切割后必须及时灭活。传统高温灭活易损伤长片段DNA的完整性；而RNP残留则会持续结合靶位点，干扰后续连接与测序，研究者常陷入"高温伤片段、低温灭不净"的两难境地。

解决方案：翌圣Thermolabile Proteinase K可在37℃条件下温和消化Cas9/Cas12a RNP的蛋白组分，实现彻底降解；随后55℃ 10 min精准灭活，全程无高温暴露、无需磁珠纯化，直接进入下一步建库反应。该方案最大程度保留长片段DNA完整性，为靶向长读长测序提供高效、高保真的一管式解决方案。^[4][5]

翌圣Thermolabile Proteinase K性能数据展示

◆ 高效消化与精准热灭活

分别使用翌圣及进口品牌Supplier A的Thermolabile Proteinase K（TLPK）处理限制性内切酶PvuII后，使用处理后的PvuII对λDNA进行处理，结果显示翌圣Thermolabile Proteinase K可有效抑制PvuII活性，且55℃ 10 min处理后，Thermolabile Proteinase K完全热失活，对后续反应体系中的添加的蛋白无影响。

图3. 消化能力与热敏感性能验证

◆ 无核酸外切酶、切口酶、RNase残留

将0.12 U Thermolabile Proteinase K分别与核酸底物孵育，并通过琼脂糖凝胶电泳分析谱带变化。实验结果表明，翌圣的3个批次Thermolabile Proteinase K均未检测到核酸外切酶、切口酶或RNase残留，为实验结果的准确性和可靠性提供了有力保障。

图4. 核酸外切酶、切口酶、RNase残留结果验证

产品选择指南

为满足多样化实验需求，翌圣生物精心推出Proteinase K系列产品，涵盖普通型与热敏型两大品类。普通型Proteinase K适用于常规蛋白降解场景，而热敏型产品则凭借快速热灭活特性，为下游分子生物学实验提供高效解决方案，为科研工作者提供精准适配的实验工具选择。

产品名称	产品编号	产品特点
Thermolabile Proteinase K	14809ES	热敏款，适用于反应后需要去除Proteinase K活性的场景
Proteinase K	10401ES	粉末状，可以根据实验要求，配制成目标浓度
Proteinase K Solution (20 mg/mL)	10412ES	液体，免配制，使用起来更方便
Proteinase K Solution (RNase-Free, DNase-Free)	10410ES	极低的背景菌残留，更适合病原微生物核酸提取

参考文献

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