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Lymphocyte separation medium1.084 淋巴细胞分离液1.084
产品货号:40504ES60
产品规格:100 mL
产品价格:¥546.00
类别:细胞分离与消化

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  • HB180709


    产品信息

    产品名称

    产品编号

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    价格(元)

    Lymphocyte separation medium1.084 淋巴细胞分离液1.084

    40504ES60

    100 mL

    4-30 °C

    546.00


    产品描述

    淋巴细胞分离液(Lymphocyte Separation Medium 1.084,简称LSM-1.084)是一种无菌的即用型分离液,基于BöyumFicoll-甲泛影钠溶液做过一些改良,使得操作简单快速且分离效率更高。本品是无菌的聚蔗糖Ficoll/泛影酸钠混合溶液,密度为1.084 g/mL内毒素含量很低(<0.12 EU/mL),是在严格控制的环境下加工生产的,生产条件符合ISO13485:2003标准和GMP认证。相对于密度为1.077 g/mL的人淋巴细胞分离液,本品适用于分离更高密度的人单个核细胞,包括外周血,脐带血以及骨髓瘤来源的组织样本。还适用于分离大小鼠血细胞,正因为啮齿动物的淋巴细胞密度稍高于人淋巴细胞。


    工作原理

    去纤维蛋白或抗凝人血以11的比例用无菌生理盐水或平衡盐溶液稀释,小心的添加在分离液上层(不要混杂在一起),之后离心30-40 min。离心过程中,差速迁移使其最终形成几个不同的细胞分层

    ①  聚集在管底的颗粒主要是Ficoll 聚集的红细胞以及沉淀物;

    ②  紧挨着上面一层的颗粒主要是粒细胞,其处于LSM-1.084溶液的渗透压临界,具有足够高的密度迁移穿过LSM-1.084溶液层。

    ③  单个核细胞分布在血浆和LSM-1.084分离液的中间层,还包括一些沉降系数低(密度低)的颗粒,如血小板。

    淋巴细胞,单核细胞和血小板不具有足够高的密度穿透LSM-1.084分离液层,因此这些细胞在血浆和LSM-1.084分离液层聚集形成一个中间分层。吸取中间层,用平衡盐溶液短暂洗涤,以除去血小板,细胞分离介质和血浆,就可以单个核细胞。通常情况下,分离所得的细胞中95±5%为单个核细胞,细胞存活率>90%,回收率为60±20%


    运输与保存方法

    室温运输

    4-30 °C密闭避光环境下可稳定保存3年。开瓶后需4-8 °C保存。


    影响单个核细胞分离效果的因素

    1. 血液样品保存时间

    血液尽可能新鲜且无血块。血液放置过久可能会降低细胞存活率、回收率,甚至有可能引入粒细胞和/或红细胞污染。

    2 .血液体积

    血液量和管径决定样本在管子中的高度,以及后续的离心时间。提高离心管内的血液高度会引入红细胞污染的可能。但是分离效率不会明显受管径的影响。因此,对于体积大的血样,建议可在保持离心时间不变的情况下选择更大直径的离心管。

    3 .红细胞去除

    单个核细胞分离的产量和纯度与红细胞是否去除干净有关。

    若全血中红细胞发生凝集会导致一些单个核细胞也被聚集在内,从而在离心后被沉降在红细胞层内。可通过稀释全血的方法来避免此现象。温度大小会影响红细胞的凝集,18℃条件能提供最佳的分离效果。若温度升高(如37℃)会提高红细胞凝集的可能,降低分离效果。低温(4℃)环境红细胞聚集可能降低,需要增加离心时间。提高离心时间到5-10 min能减低红细胞污染。

    4 .血小板污染

    对于血小板要求较为严格的分离实验,使用4-20%的蔗糖梯度层加在LSM-1.084溶液层上方,再次离心以去除所有的血小板。离心后,血小板分布在蔗糖溶液上方,单个核细胞穿过蔗糖溶液停留在LSM-1.084溶液上方。


    操作方法

    1. 材料准备

     样本体积(4 mL总体积):取2 mL的去纤维蛋白或抗凝血,将其与等体积(2 mL)的无菌盐溶液以1:1比例混合。注:大体积的血样可以得到相同的分离效率,只需要选用更大直径的离心管,以维持血样的高度(约3 cm)和LSM-1.084溶液的高度(约2.4 cm)。

     LSM-1.084分离液,使用前需放到室温环境下温度平衡10-30 min;

     平衡盐溶液:用做稀释和清洗液,建议直接购买商业化的盐溶液。也可以使用其他溶液,如不含Ca2+/Mg2+的磷酸盐溶液(如DPBS溶液),Hanks,或者细胞培养液(如RPMI 1640)。

    2. 分离单个核细胞
    1)取2 mL的去纤维蛋白或抗凝血,将其与等体积(2 mL)的无菌盐溶液以1:1比例混合,于10-15 mL离心管中颠倒混匀,或用枪上下轻轻吹打数次以至混匀。注:肝素、EDTA、柠檬酸钠、ACD、CPD抗凝皆可。去纤维蛋白血不需要抗凝剂。
    2)使用前轻轻颠倒瓶子使LSM-1.084充分混合,用注射器或枪头无菌条件转移3 mL LSM到10-15 mL离心管中。
    3)小心将稀释血液加入3 mL LSM-1.084(室温即可)的上层,使得在血液和LSM间形成一个明显的分层。不要将稀释血液混入LSM-1.084中,如图1;



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                                                                                                 图1 加样后分层示意图

    4)室温下400×g离心30-40 min,离心可以沉淀红细胞和多形核白细胞,同时可以在LSM-1.084上形成一层单核-淋巴细胞分层,如图2所示(从上到下,依次分为血浆层-单个核细胞层-LSM-1.084层-粒细胞-红细胞);
    5)用无菌枪头吸掉单个核细胞层(含淋巴细胞和单核细胞)上方2-3 mm的血小板/血浆,小心操作勿吸入单个核细胞层内破坏其平衡(如图2)。

    注:也可以不用先吸走血浆层,直接用枪吸取单个核细胞层。另外,上层血浆不含细胞,也可以留作他用。

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    2  吸除上层血浆和血小板前后分层示意图

    6)用无菌枪头将单核细胞层转移入一个新的无菌离心管。

    注:一定要吸取所有的单个核细胞中间层,以及少量上方的血浆液和下方的LSM-1.084分离液。

    7)预估转移后的单个核细胞量,加入至少3倍体积(约6 mL)的平衡盐溶液于上述离心管中。

    8)使用枪头上下轻轻吹打将单层细胞溶液充分悬浮。

    9)室温400-500×g离心10-15 min。

    注:高速离心有助于提高单个核细胞的回收率,但如果需要彻底去除血小板,则推荐低速离心(60-100×g)。

    10)去除上清,加入6-8 mL平衡盐溶液重悬单核细胞。

    11)室温400-500×g(或者60-100×g去除血小板)离心10 min。

    12)去除上清,用适当培养基重悬单个核细胞备用。

    3. 分离粒细胞

    1)-6)同上方单个核细胞的分离步骤。

    7)小心吸除LSM-1.084层,注意切勿吸入粒细胞层。

    8)转移暴露在表面的白色粒细胞层(位于红细胞层上方)于一个无菌的50mL离心管。

    9)加入至少5倍体积的平衡盐溶液重悬粒细胞,于400×g离心15 min

    10)吸除上清,加入6-8 mL平衡盐缓溶液重悬粒细胞,于室温400-500×g离心10 min。

    11吸除上清,用适当培养液重悬粒细胞备用。


    注意事项

    1)稀释去纤维蛋白血液或肝素化血液用的盐溶液为无菌液体;

    2)为保持淋巴细胞的活性,应该采血后尽快进行分离。分离细胞层实际上是单个核细胞层,包括淋巴细胞和单核细胞。

    3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;