ND-2000测定出来的核酸浓度是准确的吗？

翌圣生物核酸提取系列产品，上市前严选质控指标，上市后产品不良投诉率极低。但近来，遇到了部分客户反馈“质粒提取得率低”“DNA提取产量低于其他产品”，究其根源，“NanoDrop 2000(ND-2000)”式的直接读取待测物质浓度早已成为实验室判定核酸浓度高低的黄金法则。然而，这可信吗？

作为翌圣生物公众号的老粉丝，相信你肯定有注意过我们反复推出的一篇技术干货《qPCR实验还在纠结cDNA浓度低？小翌带你走出误区》，文章得出了两条重要结论：

1.不同品牌逆转录产品的cDNA浓度（ND-2000测定）相差较大，但定量实验Ct值几乎一致。

2.逆转录体系中dNTP 投入量的多少会使cDNA浓度的测定结果产生较大差异，但最终Ct值几乎一致。

（数据引用自“qPCR实验还在纠结cDNA浓度低？小翌带你走出误区”）

 

至此，我们引发了思考：ND-2000测定出来的核酸浓度是准确的吗？

 

ND-2000式的核酸浓度测定悖论

众所周知，ND-2000是依据任何物质在紫外可见光范围内的特定波长下可检测到吸光度值，诸如260nm处可检测dsDNA、ssDNA、RNA、dNTPs；280nm处检测蛋白质、乙醇；230nm处检测裂解常见组分硫氰酸胍、盐酸胍、EDTA、Triton™ X-100、Tween^® 20苯酚等。因此，“pure”dsDNA通过测定得出我们熟知的几个数值：A260=1相当于50ng/µl；A260/280≈1.8；A260/A230≈2.0-2.2。类似地，“pure”RNA亦有类似数据。此数据被用于浓度评测和核酸纯度分析。

然而，仪器厂家深知上述数据的偏差性，所以资料显示比值仅作为样本质量的参考指标，最佳的评测指标是后续的实验应用。

同时，也指出比值正确的样品，样本质量也可能并不佳！所以：

“Pure”dsDNA is A260/A280≈1.8；A260/A230≈2.0-2.2；

But A260/A280≈1.8；A260/A230≈2.0-2.2 ≠“Pure”DNA。

在此基础上，我们不难明白：吸光度值测定物质缺少特异性。所以，ND-2000式的核酸浓度测定属于一个悖论！

 

 

 

打破悖论，准确定义提取产量

但下游应用是需要做核酸浓度测定和核酸质量评估以保证定性或定量的研究和分析，那么使用提取类产品应该如何进行核酸提取质量的比较呢？

1. 胶图决定核酸质量，判定产物是否“Pure”

首先，要明白对于核酸提取产物而言，浓度与纯度谁更重要？答案：纯度更重要。琼脂糖凝胶电泳图是比较直观的核酸纯度分析方法。

表1. 购买市面两家主流产品，提取拟南芥基因组DNA

图1.  市面两家主流产品，提取的拟南芥基因组DNA电泳图

可以看出，胶图较ND-2000的判定结果更为准确！
2. 翌圣生物提取系列产品“胶图+下游应用测试”，保证产品竞争力

注：Y代表Yeasen产品，T代表其他品牌同类产品

总之，选取一款高质量的提取试剂盒作为实验开始的担保，得到的DNA/RNA足够纯，那么浓度测定也更为准确，做下游定量、定性实验结果更有保证！

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HB20201202