NGS，或称二代测序（当然还有三代测序和四代测序），即使您未曾深入了解过，可能也早已听说过。那么，NGS到底是什么？它究竟在研究什么？今天，我们就来为大家详细解读一下。
二代测序相关的技术主要可以分为三大类：DNA研究相关技术、RNA研究相关技术以及表观遗传研究相关技术。二代测序的技术和应用目前是最广泛的，因此本文将重点围绕二代测序展开，为大家全面介绍这项颠覆性技术的方方面面。
图1.NGS测序图鉴
DNA研究相关技术
DNA相关研究技术主要步骤离不开：DNA提取、DNA片段化、DNA文库构建、测序和数据分析。
乍一看，DNA相关研究技术的操作步骤好像并不复杂。但如果你因此觉得 DNA 研究是件轻而易举的事，那你可能就有点想得太简单了！
全基因组测序（WGS）是DNA研究中的核心技术，自人类基因组计划完成以来，人类正式迈入基因组时代。随着越来越多物种基因组被解析，相关的生信分析方法也不断涌现，如果要细说基因组的故事，可能要讲上几百年，这里就不展开了。需要注意的是，在进行二代测序研究前，应先确认研究物种是否已有参考基因组，有些人可能会提到无参分析，但这往往是不得已而为之，在有参考序列的情况下，建议优先采用有参分析，以确保更高的效率和准确性。
基因组测序还包括全基因组重测序和简化基因组测序，广泛应用于遗传图谱构建、种质资源鉴定、动植物育种、结构变异检测、性状基因定位和群体进化分析等领域，这些技术衍生出如BSA、SNP、Indel、SV、QTL、GWAS等专有分析方法，都是依据样本数量和需求调整。此外，宏基因组测序用于环境样本（如土壤、粪便、肠道、水体）和病原样本研究，扩增子测序（如DNA条形码、16S/18S/ITS测序等）则应用于群体基因部分序列分析、食性研究和功能基因组学等领域。
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试剂类别 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
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酶切法建库 |
12972ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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12194ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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12316ES24/96 |
24/96 T |
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机械法建库 |
12927ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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多重PCR |
12983ES08/24/96 |
8/24/96 T |
RNA研究相关技术
RNA相关研究技术的主要步骤和DNA一样，离不开RNA提取、ｍRNA捕获（ｒRNA去除）、RNA文库构建、测序和数据分析。
RNA研究目前主要的研究对象是ｍRNA、miRNA、circRNA、lncRNA以及tRNA。根据研究对象的特性，建库的方法也不相同。比如mRNA有polyA尾，所以使用oligo dT beads捕获ployA；而miRNA因为片段较小，通常用非变性胶跑胶检测后切胶回收，circRNA建库分两种情况，一种是只构建circRNA的文库，这种时候，需要先去除线性化的RNA，再来构建circRNA的文库，当然，还有另外一种就是用去除rRNA的方式构建lncRNA文库，这样既能够得到mRNA信息、lncRNA的信息，还能得到部分circRNA；研究tRNA，需要特异性捕获tRNA的发夹结构，然后加上去甲基化的步骤，之后构建tRNA文库。
图2：不同RNA建库流程汇总
在这里，要讲一个特殊的转录组研究，就是单细胞RNA-seq，单个细胞因为RNA量少，使用常规的建库方法通常容易失败。这时，我们需要让整个实验尽量在一管中进行，而不是常规的需要在整个实验流程中不断地更换EP管。目前，大多采用的是磁珠来实现一管式操作。因为建库时，通常构建的是mRNA文库。
图3.Smart-seq2实验流程
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试剂类别 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
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RNA建库 |
12308ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit(Premixed version) |
12310ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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12340ES24/96 |
24/96 T |
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12341ES24/96 |
24/96 T |
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单细胞RNA建库 |
12502ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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mRNA抓取 |
12629ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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rRNA去除 |
12254ES24/96 |
24/96 T |
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12257ES24/96 |
24/96 T |
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12258ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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珠蛋白去除 |
12260ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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12806ES24/96 |
24/96 T |
表观组学相关技术
表观组学主要研究的是核酸不发生变化，但是表型发生变化的机制。目前表观组学研究分为四大部分：甲基化研究、组蛋白修饰研究、染色质重塑研究以及非编码RNA调控研究。而这中间涉及的技术类型非常的多。
图4：表观遗传调控图鉴
甲基化研究
甲基化研究分两大类，一类是DNA甲基化，一类是RNA甲基化。DNA甲基化目前研究的是5mC和6mA两大修饰类型，而5mC研究的技术类型有WGBS、RRBS、oxBS、meDIP-seq和hmeDIP-seq，6mA研究的技术类型有6mA-IP-seq。RNA甲基化研究也是有5mc和6mA，使用的技术也是meDIP和meRIP。
不同的甲基化研究技术，使用的不同的技术原理。WGBS主要是通过使用亚硫酸盐处理后，非甲基化的C碱基被转化成U，之后在PCR扩增中被转化成T。这种方法是最经典的全基因组甲基化研究方法，也是甲基化研究的金标准，能得到全基因组范围内的甲基化修饰情况。RRBS主要是利用甲基化敏感性酶来对基因组DNA进行酶切，捕获的区域主要是CpG岛。OxBS技术主要是研究羟甲基化修饰。在实验过程中，需要构建两个文库，一个是常规的WGBS，另一个文库先通过酶来转化甲基化修饰状态的中间态，即通过酶氧化将5hmC氧化成5fc，之后亚硫酸盐处理时，这些甲基化中间状态都能被转化成U，然后通过生信的方法来进行换算。另外一大类就是使用特异性抗体来进行靶向捕获，比如meDIP、hmeDIP和6mA-IP-seq以及meRIP。
组蛋白修饰研究
组蛋白修饰的研究，主要是研究各种不同的组蛋白修饰参与的染色质调控和基因的表达调控。研究的技术是以ChIP-seq为代表的DNA与蛋白互作的技术。这些技术类型有ChIP-seq、CUT&RUN和CUT&tag。
染色质重塑研究
染色质重塑研究，主要是研究染色质重塑因子的染色质调控和基因表达调控。研究的技术类型与组蛋白修饰一致，也是ChIP-seq、CUT&RUN和CUT&tag。
图5.DNA-蛋白互作技术流程
除了上述介绍的DNA-蛋白互作技术外，DAP-seq 也是一种研究 DNA-蛋白互作的重要方法。该技术属于体外实验，非常适
合用于研究非模式物种的 DNA-蛋白互作。其优势在于无需依赖抗体或转基因体系，从而简化了实验流程。然而，由于是在体外条件下进行，DAP-seq 可能会产生较多假阳性结果，需要谨慎解读数据。
图6.DAP-seq实验流程
还有染色质开放性研究技术ATAC-seq，它主要是利用tn5酶来切割染色质开放区域，之后对这些开放区域DNA进行建库后分析。
图7：ATAC-seq建库流程
非编码RNA调控
非编码RNA调控，除了有常规的RNA建库外，还有RNA-蛋白互作技术研究。最经典的研究就是关于RNA结合蛋白（RBPs）的研究。主要是通过RNA pull down及RIP-seq/CLIP/miCLIP/eCLIP等技术来实现研究目的。
RNA pull down主要是通过用已知的RNA来pull未知的互作蛋白，对拉取下来的蛋白进行质谱鉴定。而RIP/CLIP/miCLIP/eCLIP主要是用已知的RNA结合蛋白来调取互作的RNA。通常，我们可以选择RNA pull down和RIP/CLIP/miCLIP/eCLIP同时进行，对需要验证的RNA和RBP进行正向和反向验证。
图8.eCLIP实验流程
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试剂类别 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
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甲基化转化 |
12225ES10/50 |
10/50 T |
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单链建库 |
12221ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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双链建库 |
12214ES08/24/96 |
8/24/96 T |
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ATAC建库 |
12208ES04/12/48 |
4/12/48 T |
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CUT&Tag建库 |
Hieff NGS® In-Situ DNA Binding Profiling Library Prep Kit for Illumina® V2 |
12597ES04/12/48 |
4/12/48 T |
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小片段纯化磁珠 |
12600ES03/08/56/75 |
1/5/60/450 mL |
配套产品推荐
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试剂类别 |
产品名称 |
货号 |
规格 |
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纯化磁珠 |
12601ES03/08/56/75 |
1/5/60/450 mL |
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接头 |
12412ES02 |
96×2 T |
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13361ES02/04/96 |
16×2 T/16×4 T/16×100 T |
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定量 |
12642ES60/76 |
100/500 T |
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片段化末修加A模块 |
12619ES24/96 |
24/96 T |
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末修加A模块 |
12608ES24/96 |
24/96 T |
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连接模块 |
12805ES24/96/98 |
24/96/1000 T |
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扩增模块 |
13344ES24/96/97 |
24/96/500 T |
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耐U高保真酶 |
12928ES30 |
5 mL |
