产品简介

 

CelCulSF^TM NK Cell Culture Medium（Serum-free）培养基是一款专为NK细胞培养而设计的无血清（Serum-Free）、无异源动物源成分、使用药用级别原辅料的扩增培养试剂盒。NK细胞无血清培养基适用于自体外周血或脐血PBMC，经体外活化扩增获得纯度较高的NK细胞。

 

组分信息

 

组分编号	组分名称	40146ES84
40146-A	NK细胞添加物A	200 μL
40146-B	NK细胞添加物B	500 μL
40146-C	NK细胞添加物C	500 μL
40146-D	NK细胞添加物D	500 μL
40146-E	NK细胞无血清基础培养基	1000 mL × 2瓶

 

成分说明

 

纯因子法，药用级别原辅料，无血清培养，无需饲养细胞。

 

储存条件

 

NK细胞无血清基础培养基，2~8℃，有效期18个月；

NK细胞添加物，-20℃，有效期18个月。

 

使用说明

 

1.包被：细胞活化瓶预处理（第-1天）

40146-A和13 mL D-PBS混匀，加入175 cm²培养瓶中，平放晃匀铺满，或40146-A和9 mL D-PBS混匀，加入75 cm²培养瓶中，平放晃匀铺满，4℃冰箱平放过夜。次日种瓶前吸弃包被液。

2.种瓶：外周血 PBMC 分离与诱导（第0天）

1）分离血浆：取少量血样（约300 μL）划线或滴入平皿进行检菌。室温下离心15分钟，取离心上清作为血浆。

2）血浆灭活：上层血浆56℃灭活30 min，置于4℃冰箱30 min，取出在室温下离心10 min，取上清备用。

3）分离PBMC：等体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀，加到Ficoll层上使分层保持清晰，室温下离心25 min。

4）洗涤细胞：吸取PBMC层，加生理盐水吹打混匀，室温下离心5 min（脐血建议8 min），再次洗涤细胞。

5）细胞计数：弃上清，用少量完全培养基重悬细胞，吸取少量细胞计数。调整细胞密度2×10⁶个/mL。

6）种瓶：吸弃包被液，将细胞悬液中加入40146-B，灭活血浆2.5 mL，转入培养瓶内，培养终体积约25 mL。剩余血浆4℃密封保存备用。

注：完全培养基的配置：每瓶培养基加入1支IL-2，终浓度为1000 IU/mL。包被瓶从冰箱取出的时间约为细胞加入前的10 min。

3.培养 第一次补液（第3天）

1）显微镜下观察细胞，确定是否可以补液。①瓶底贴壁的克隆团达到瓶底面积的30%以上。②颜色与初始培养液比偏黄。（如无法判断，可推迟一天补液。）

2）补液操作。加入40146-C和3.5 mL灭活血浆，再加入约46.5 mL完全培养基，培养终体积为75 mL。

注：请勿吹打细胞

4.培养 第二次补液（第5天）

加入40146-D，和8.75 mL灭活血浆，再加入约166.25 mL完全培养基，培养终体积定容到250 mL。

注：请勿吹打细胞，第5天开始细胞增殖较明显，中大团变多且分裂相形态细胞居多。

5.装袋第三次补液（第7天）

剩余血浆加入培养瓶，再将培养瓶中的细胞悬液转入细胞培养袋中，随后补液（约350 mL完全培养基，也可按密度补液，补液后密度在0.6~1×10⁶个/mL范围内），培养终体积定容到600 mL。

注：装袋前，轻微拍打培养瓶底部细胞，如克隆团太大可进行吹打，注意吹打的力度避免将克隆团吹成单个细胞。

6.分袋第四次补液（第9天）

1）配置另一瓶NK完全培养基。

2）将培养袋中的细胞悬液分出一半加入新的培养袋，随后每袋再补入300 mL完全培养基。（培养终体积为1200 mL）

7.第五次补液（第11/12天）

将剩余的约800 mL完全培养基均分到2个培养袋中，每袋终体积约1000 mL。

8.检验（第13天）

5 mL注射器分别从袋内抽取少量细胞悬液进行细菌、内毒素、支原体检测。

9.收获（第14/15天）

正常情况下，第14、15天各收获1000 mL细胞悬液。

 

注意事项

 

1.血样要求

1）外周血PBMC>3×10⁷cells（推荐采血量50 mL左右，用肝素钠真空采血管），建议采血后4小时内操作，建议做淋巴细胞亚群分析。不建议使用冻存的外周血。

2）脐带血（不含抗凝剂）推荐采血量>50 mL，建议把采血袋中抗凝剂抽出至少一半（大约14 mL），其他容器建议抗凝剂不超过14%（或PBMC>3×10⁷cells），采血后12小时内操作。

2.种瓶密度：PBMC铺瓶的起始细胞密度建议2×10⁶个/mL，脐血可适当提高初始铺瓶细胞密度。

3.补液密度：补液前密度一般在1.5~2×10⁶个/mL；补液后密度一般在0.6~1×10⁶个/mL，不可低于0.6×10⁶个/mL。

4.培养基的使用：

1）每次补液前需要将培养基在室温下自然复温。

2）禁止将整瓶培养基放入37℃孵箱复温，否则会加速补液培养基中细胞因子的失活。

3）配置好的扩增培养基（含IL-2）时效较短，超过一周不建议使用，尤其是活化前期（前7天）。

5.灵活掌握补液时机：细胞扩增状态不理想时，可推迟补液时间，但是尽量不要调整补液的体积尤其注意第一次补液的时机。

6.包被时间：40146-A包被后需4℃平放过夜。

7.培养初期不要随意晃动培养瓶：否则活化的克隆团容易飘起来，而降低包被因子对细胞团的活化。

8.本产品仅作科研用途。

9.为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

Ver.CN20241016