炎症性肠病（IBD）是一组与肠道炎症性疾病和微生物菌群失调相关的慢性复发性疾病。中医（TCM）治疗结肠炎具有副作用少的优点，但分子机制尚不清楚。目前miRNA 被公认为植物中的新型功能性小分子，对生物活性具有调节作用。金银花（HS）是桃花汤的主要成分，桃花汤是中国著名的治疗IBD和溃疡性结肠炎的草药处方，它也是韩国用于治疗IBD的Bojanggunbi-tang（BGT）的关键成分。金银花（HS）具有抗病毒 、抗炎、抗血管生成、抗伤害性、抗癌和神经保护的效果。

南京鼓楼医院分子诊疗中心李菁、李靓、张玉婧团队于2024年12月在Journal of Controlled Release上发表题为 “Alleviation of colitis by honeysuckle MIR2911 via direct regulation of gut microbiota”的文章，影响因子为10.5。该研究主要探讨了治疗结肠炎的中药制剂主要成分金银花MIR2911的作用机制，确认金银花治疗结肠炎的一种新活性成分：MIR2911，发现植物miRNA进入肠道细菌新的途径：口服金银花汤（HSD）后，肠道细菌微环境中宿主sEVs的MIR2911显着增加，并被输送到肠道细菌中，并揭示了宿主sEVs递送的植物miRNA和宿主AGO2蛋白可能是肠道细菌跨境调控的重要因素。

实验目的：探究金银花来源的MIR2911是否能通过直接调控肠道菌群，缓解DSS诱导的小鼠结肠炎，明确其作用机制及相关实验依据，同时验证植物源性miRNA跨物种调控宿主生理功能的特性。

实验动物：8周龄SPF级BALB/c小鼠，体重20±2g，雌雄各半（每组6只，n=6），适应性饲养1周（温度22±2℃，湿度50±5%，12h光暗周期，自由摄食标准饲料及饮水）。

分组设置：实验分为四组，每组6只小鼠，分别为正常对照组（Control组）、DSS模型组（DSS组）、金银花MIR2911干预组（MIR2911组）、金银花煎剂治疗组（HSD组）；其中正常对照组给予高压灭菌饮用水，DSS模型组给予2.5%（w/v）DSS（分子量36000-50000 Da）饮用水，持续7天以诱导结肠炎；MIR2911干预组在给予2.5% DSS饮用水的同时，通过灌胃方式给予金银花来源的MIR2911（纯度≥98%，经高效液相色谱法验证），剂量为50μg/kg体重，每日1次，同步持续7天；金银花煎剂治疗组（HSD组）在给予2.5% DSS饮用水的同时，通过灌胃方式给予金银花煎剂，剂量为500 mg/kg体重，每日1次，同步持续7天（金银花煎剂经浓缩纯化，浓度为50 mg/mL，灌胃体积10μL/g体重，与MIR2911干预组灌胃体积一致，确保干预条件统一）；第8天所有小鼠均恢复正常高压灭菌饮用水，停止DSS诱导及灌胃干预，所有小鼠均在第9天处死，收集相关样本进行检测。

核心实验指标：小鼠体重变化（每日监测，计算体重变化率）、粪便潜血及稠度（评分量化）、结肠粘膜损伤程度（内镜评分+组织学评分）、肠上皮细胞增殖迁移能力（BrdU阳性细胞数）、肠渗透性（血清FITC-Dextran浓度）、脾脏及结肠形态学指标（结肠长度、结肠重量/体重比、脾脏重量/体重比）、结肠MPO活性、炎症相关基因（TNF-α、IL-6、IL-1β、ZO-1、Occludin）表达水平、肠道菌群组成（16S rRNA测序）及促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）水平。

2.1 称重标记与分组给药

在DSS给药的当天(第0天)，对所有小鼠进行称重、标记，记录初始体重（20±2g），采用随机数字表法分为正常对照组、DSS模型组、MIR2911干预组、HSD组，每组6只，确保每组小鼠体重、性别无统计学差异（P>0.05）。DSS给药前收集各组小鼠粪便（每只小鼠收集0.1-0.2g），作为检测炎症粪便标记物及肠道菌群基础水平的对照。用高压灭菌水制备2.5%（w/v）DSS水溶液（磁力搅拌30min至完全溶解，4℃冷藏保存，24h内用完），DSS模型组、MIR2911干预组和HSD组均给予该DSS水溶液，正常对照组给予相同量的高压灭菌水（不含DSS）；同时MIR2911干预组通过灌胃方式给予金银花来源的MIR2911（用生理盐水溶解，浓度为5μg/mL，灌胃体积10μL/g体重，每日1次，固定在上午9:00-10:00灌胃），HSD组通过灌胃方式给予金银花煎剂（用生理盐水稀释，浓度为50 mg/mL，灌胃体积10μL/g体重，每日1次，与MIR2911干预组同步灌胃），正常对照组和DSS模型组给予等量生理盐水灌胃，持续干预7天。第8天所有小鼠停止DSS诱导及灌胃干预，统一恢复正常高压灭菌饮用水；通过测量每日剩余水量，计算各组小鼠日均水摄入量（确保每组小鼠日均水摄入量为4-6 mL/只，DSS摄入量一致）；同时结合预实验结果，若出现小鼠死亡率≥20%，表明对DSS高度敏感，应将DSS浓度降至2.0%；若未观察到结肠炎或结肠炎较轻（粪便评分≤1分，体重变化率≥-5%），表明易感性较低，应将DSS浓度提升至3.0%或延长干预时间至10天。

每天定时（上午8:00）测量各组小鼠体重，记录体重数据并计算体重变化率（体重变化率=（当日体重-初始体重）/初始体重×100%）；同时监测粪便稠度及潜血的存在，采用以下评分系统进行肠出血及肠道炎症程度的比较分析，每日记录每组小鼠平均粪便评分。

2.2 粪便收集与处理

分别在给药第0天、第3天、第7天（DSS诱导及干预结束当天），将单只小鼠放置在没有垫料的空笼子中15-30 min收集粪便（随着DSS给药的继续和炎症变得更加严重，收集所需的时间将会增加，第7天收集时间可延长至30-40 min）。用无菌镊子将粪便收集在无菌微量离心管中（每管0.1-0.2g），做好分组、日期标记，一部分（约0.05g）用于潜血监测（采用粪便潜血试纸检测，严格按照试剂盒说明书操作），另一部分（约0.15g）用于肠道菌群检测及炎症标记物检测，其中用于测量炎症标记物和肠道菌群的粪便需立即置于-80℃冻存，避免样本降解，冻存前加入1mL无菌PBS，涡旋振荡30s，制成粪便匀浆后分装冻存，便于后续检测。第8天恢复正常饮水，不收集粪便，第9天小鼠处死后，额外收集粪便样本用于后续检测。

2.3 结肠粘膜损伤观察

小鼠处死后，对DSS诱导的结肠粘膜损伤进行体内观察。在1.5-2.0%异氟烷麻醉下，用1mL注射器向结肠内注入0.5mL空气，使结肠膨胀后，用体视显微镜观察3 cm的近端结肠，通过评估以下指标对内窥镜损伤进行评分（每组随机选取5只小鼠进行观察），比较三组小鼠结肠粘膜损伤程度，明确MIR2911对结肠粘膜的保护作用。实验数据显示，正常对照组小鼠内镜评分为0.32±0.15分，DSS模型组为2.78±0.23分，MIR2911干预组为0.95±0.18分，三组间存在显著统计学差异（P<0.01）。

2.4 上皮细胞增殖迁移与肠渗透性检测

在小鼠处死前4h和24h，给各组小鼠腹膜内注射BrdU（浓度10 mg/mL，注射剂量100 μL/10g体重），通过对BrdU进行组织学特异性染色（严格按照试剂盒说明书操作），在显微镜下（×400倍）观察并计数每视野BrdU阳性细胞数（每组选取5只小鼠，每只小鼠选取3个视野），监测肠上皮细胞的增殖和迁移能力。

处死当天，小鼠禁食4h后，灌胃给予溶于0.1 mL PBS中的FITC-Dextran(4 KDa，0.6 mg/g体重)，3h后通过眼眶取血（每只小鼠取血0.5-1 mL），置于离心管中，4℃、3000 rpm离心10 min，收集无溶血的血清，置于-80℃冻存备用。肠渗透性与适当稀释的血清的荧光强度相关（激发波长488 nm；发射波长520 nm），通过在小鼠血清中连续稀释已知量的FITC-Dextran（浓度梯度为0、10、20、40、80、160μg/mL）制备标准曲线（R²≥0.99），使用酶标仪计算各组小鼠肠渗透性水平。

为了对肠道炎症进行定量测量，通过ELISA试剂盒测量血清角质细胞衍生趋化因子(KC)和脂质运载蛋白2（与疾病活动相关），其中KC以1:2稀释对照血清样品，脂质运载蛋白2以1:200稀释对照血清样品，来自DSS处理的小鼠的样品以1:4稀释KC、1:400稀释脂质运载蛋白2；严格按照ELISA试剂盒说明书操作，在酶标仪上测量450 nm波长处的吸光度值，通过标准曲线计算血清中KC和脂质运载蛋白2的浓度。通过比较三组血清中上述炎症因子水平，进一步验证MIR2911的抗炎作用。

2.5 脾脏、结肠称重及结肠长度测量

小鼠处死后，喷洒70%乙醇消毒，通过腹部中线切口小心打开小鼠腹腔，取出脾脏并称重（电子天平，精度0.001g），计算脾脏重量/体重比（脾脏重量mg/小鼠体重g），脾脏重量的增加通常与炎症和贫血的程度相关，比较三组小鼠脾脏重量及脾脏重量/体重比，评估全身炎症反应程度。

在收集结肠之前，若计划研究肠系膜淋巴结的增大、表征免疫细胞群和/或分析与DSS诱导的病理学相关的肠道细菌移位，则分离肠系膜淋巴结备用（置于-80℃冻存）。

用镊子提起结肠，小心牵拉至盲肠可见，将结肠和盲肠从回盲部的小肠和直肠远端的肛门中分离出来，拍摄所有小鼠组或每组一名代表从盲肠到直肠的肠的大体照片，直观观察结肠形态差异。用直尺测量结肠长度（拉直结肠但不拉伸，精度0.01cm），记录数据并比较三组差异；随后将结肠从盲肠中分离，用冷PBS快速冲洗以除去粪便和血液，冲洗后称重（电子天平，精度0.001g），计算结肠重量/体重比（结肠重量mg/小鼠体重g），根据观察到的组织消耗情况，比较三组结肠重量及结肠重量/体重比（严重发炎的结肠通常显示重量减轻），明确MIR2911对结肠形态的保护作用。

2.6 结肠过氧化物酶(MPO)检测

结肠MPO是中性粒细胞的标志，其在组织中的浓度与中性粒细胞浸润的程度相关，可反映肠道炎症严重程度。称量各组小鼠结肠组织(50-100 mg，精确至0.1mg)，在PBS中彻底清洗至无粪便物质，加入500 μL MPO提取液（含0.5% Triton X-100的PBS），冰浴匀浆（功率200W，每次30s，间隔30s，重复3次），4℃、12000 rpm离心15 min，收集上清液，置于-80℃下储存，待后续统一分析。采用MPO检测试剂盒，严格按照说明书操作，在酶标仪上测量460 nm波长处的吸光度值，通过标准曲线计算MPO活性（U/mg protein），比较三组小鼠肠道中性粒细胞浸润情况，验证MIR2911对肠道炎症的抑制作用。实验数据显示，正常对照组结肠MPO活性为2.18±0.34 U/mg protein，DSS模型组为12.35±1.56 U/mg protein，MIR2911干预组为4.87±0.62 U/mg protein，MIR2911可显著降低结肠MPO活性，减少中性粒细胞浸润，减轻肠道炎症。

2.7 qRT-PCR分析

取各组小鼠结肠组织一片(50 mg，精确至0.1mg)，置于RNAlater中保存至RNA提取；对于更长时间的储存，将RNAlater中的组织置于-20℃下冷冻。提取RNA当天，从RNAlater中取出结肠组织，采用Trizol试剂，通过标准程序提取总RNA，用Nanodrop核酸检测仪检测RNA纯度（A260/A280比值在1.8-2.0之间为合格）和浓度（≥100 ng/μL）；由于结肠组织中的微量DSS会干扰PCR扩增，需通过氯化锂法去除所有多糖（包括DSS），避免影响实验结果。

2.8 组织学染色与评分

纵向切开每一片结肠，用PBS浸湿的牙签包住，放入样本盒中；在10%福尔马林缓冲液中固定24h后，转移到70%乙醇中保存至分析。对于使用特定抗体的特殊染色(如免疫组织化学、免疫荧光)，将冷冻切片固定在防冻包埋介质OCT中；若研究粘蛋白层和细菌粘附/移位，不使用PBS冲洗结肠，直接浸入Carnoy溶液中，以保留粘液结构。福尔马林固定的结肠组织经梯度脱水、石蜡包埋、切片（厚度5 μm）后，进行H&E染色和BrdU染色，同时采用Ki67染色测量上皮细胞增殖能力（Ki67阳性细胞数/视野），在显微镜下（×400倍）观察，比较三组小鼠肠上皮细胞增殖差异及结肠组织病理变化。

2.9 体外培养洗涤的菌落与肠道菌群检测

取纵向切开的结肠片段(约1.0 cm)，在HBSS缓冲液中用1.0%抗生素(青霉素和链霉素，浓度均为100 U/mL)连续清洗三次，每次5 min，去除表面杂菌；将洗涤过的菌落置于含有1.0 mL无血清RPMI1640培养基和1.0%抗生素(青霉素和链霉素)的24孔板孔中，在37℃、5.0% CO₂培养箱中孵育24h。收集上清液，在4℃、3000 rpm下离心10 min，收集上清液，置于-80℃下储存，待后续通过ELISA试剂盒分析促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）水平，进一步验证MIR2911的抗炎作用。

同时，取之前冻存的粪便样本及结肠组织样本，采用粪便DNA提取试剂盒，严格按照说明书操作，提取肠道菌群总DNA，用Nanodrop核酸检测仪检测DNA纯度（A260/A280比值在1.8-2.0之间）和浓度（≥50 ng/μL），通过16S rRNA测序（测序区域为V3-V4区）等方法，分析三组小鼠肠道菌群的组成、多样性及丰度差异。

1）小鼠选择：成功且容易复制的DSS结肠炎诱导的最佳年龄在6-8周之间，优选8周龄；推荐C57BL/6J和BALB/c小鼠，因其在文献中普遍存在，对DSS敏感性适中，实验重复性好，本实验选用8周龄BALB/c小鼠（体重20±2g，雌雄各半），符合实验要求；小鼠需适应性饲养1周，确保状态稳定后再开始实验，避免因环境应激影响实验结果。

2）建议尽可能少地更换笼子：鼠类的粪食作用有助于关键营养物质的再循环，且肠道菌群的稳定对实验结果影响较大；每天更换笼子可能会导致小鼠食物和水的消耗增加，同时破坏肠道菌群平衡，若任何笼子需要更换，所有组的笼子应同时更换，减少组间差异；饲养环境温度、湿度、光暗周期需保持一致，避免环境因素干扰实验。

3）最好在给药当天制备DSS水：DSS水应在服用前用磁力搅拌棒彻底混合并完全溶解（搅拌30min以上），未溶解的盐可能会堵塞水瓶的出水口或影响水的摄入，导致给药剂量不准确，进而产生错误的实验结果；制备DSS溶液时，最好使用高压灭菌水，对照组应给予相同的高压灭菌水，确保实验条件一致；DSS溶液制备后需4℃冷藏保存，24h内用完，避免DSS降解影响诱导效果。

4）建议先做预实验：建议先做预实验，设置2-3个DSS浓度（2.0%、2.5%、3.0%）、2-3个金银花MIR2911干预剂量（25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg）及2-3个金银花煎剂（HSD）干预剂量（250 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg），每个浓度/剂量设置2-3只小鼠，观察小鼠状态、结肠炎症状出现情况及两种干预方式的效果，选取最佳的DSS剂量（本实验选取2.5%）、MIR2911干预剂量（本实验选取50μg/kg）及HSD干预剂量（本实验选取500 mg/kg），确保正式实验的顺利进行和结果的可靠性；预实验中需密切监测小鼠死亡率，若死亡率≥20%，需调整DSS浓度；预实验需确保与正式实验条件一致。

5）样本处理注意事项：用于肠道菌群检测、炎症标记物检测的粪便及结肠样本，需及时冻存（-80℃），避免样本降解；粪便样本冻存前需制成匀浆，便于后续DNA提取和炎症标记物检测；提取RNA时，需通过氯化锂法去除DSS干扰，确保qRT-PCR结果准确，RNA纯度需控制在A260/A280比值1.8-2.0之间；组织学染色时，根据检测目的选择合适的固定液（福尔马林用于常规固定，Carnoy溶液用于保留粘液结构），避免破坏检测靶点（如粘液层、细菌），H&E染色需严格控制脱水、包埋、染色时间，确保染色效果清晰，便于组织学评分；肠道菌群DNA提取采用粪便DNA提取试剂盒，严格按照说明书操作，确保DNA纯度和浓度符合测序要求。

研究发现金银花汤（HSD）使小鼠体重减轻、结肠缩短和炎症减轻反应，用从HSD中提取小RNA治疗处理小鼠的促炎细胞因子IL-1β水平显著降低，而抗炎因子IL-10的水平升高。

从HSD中提取的所有短RNA片段（<30 nt）中选择了丰度较高的几种 miRNA（peu-MIR2911、osa-MIR156、osa-MIR168、osa-MIR167、osa-MIR159、osa-MIR166）进行qRT-PCR 验证，发现MIR2911的丰度最高。通过给IBD小鼠灌胃MIR2911，发现其可显著改善IBD症状。而通过将添加了反义MIR2911（阻断小RNA中MIR2911的功能）的miRNAs干预IBD小鼠，发现其治疗作用消失。综上所述，这些结果表明 MIR2911是HSD中治疗IBD的主要功能成分 (Fig.1)。

使用Cy5荧光标记的MIR2911对小鼠进行灌胃，发现荧光会出现在胃、小肠和大肠中，并分别在1小时、1小时和3小时时达到峰值，12小时后，大多数组织中的荧光均消失。然而，单独的Cy5荧光并不会在组织中停留，说明MIR2911在宿主消化道内被吸收。 随后，用激光共聚焦显微镜和流式细胞术发现粪便细菌中同样存在荧光，表明MIR2911可作用于肠道细菌（Fig.2）。

对MIR2911治疗的IBD小鼠的结肠组织进行了转录组测序，对显著改变的mRNA进行了通路分析，发现与炎症性肠病相关的多个通路得到改善，如IL-17信号通路、TGF-β信号通路等。鉴于TGF-β是小鼠中MIR2911唯一报道的靶标，发现IBD小鼠TGF-β的蛋白水平和mRNA没有显著变化。

通过16S rRNA基因测序分析，发现MIR2911处理后的实验组，大肠埃希菌-志贺菌的丰度显著下降，这些细菌的变化表明MIR2911可能在减轻结肠炎症状中起到关键作用。然后，通过菌群测序发现埃希菌、志贺菌和变形菌门与IBD症状严重程度密切相关（Fig.3）。

研究发现，口服HSD后，肠道细菌微环境中宿主外泌体（sEVs）的MIR2911显著增加，并被输送到肠道细菌中。这一发现为植物 miRNA 进入肠道细菌提供了一条新的途径。

MIR2911进入肠道细菌的机制：利用差速离心、透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析等技术，发现MIR2911主要通过外泌体封装进入粪便细菌。（Fig.4）

在相关研究中，可选用翌圣生物Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) 结肠炎建模用葡聚糖硫酸钠盐MW:36000~50000（60316ES）进行小鼠结肠炎造模：

DSS结肠炎建模用葡聚糖硫酸钠盐MW:36000~50000发表文献（不完全统计）

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