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Calcein-AM/PI Double Stain Kit Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒
产品货号:40747ES76
产品规格:500 T
产品价格:¥853.00
类别:荧光探针/细胞染色

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  • HB190610


    产品信息

    产品名

    产品编号

    规格

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    价格(元)

    Calcein-AM/PI Double Stain Kit

    Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒

    40747ES76

    500T

    -20℃避光

    853.00

    40747ES80

    1000T

    -20℃避光

    1453.00


    产品描述

    Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,发绿色荧光(Ex=490 nm, Em=515 nm)。 因其在传统的Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团,增加了疏水性,使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后,Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein,从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和CFDA)相比,由于Calcein, AM细胞毒性极低,是最适合用于活细胞染色的荧光探针,而且不会抑制任何的细胞功能,如增殖和淋巴球的趋化性。

    由于死细胞缺乏酯酶,Calcein-AM仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此,Calcein-AM常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶(PI)等联合使用,同时进行活细胞和死细胞的荧光双重染色。碘化丙啶(Propidium iodide,PI)不能穿过活细胞的细胞膜,仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(Ex=535 nm, Em=617 nm),因此PI仅对死细胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用545 nm激发,仅可观察到死细胞。

    本试剂盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的双重染料,来进行活细胞和死细胞的双重染色标记,从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系,单次就200 µL细胞悬液进行染色,分别可以做500次(CAS: 40747ES76)和1000次(CAS: 40747ES80)检测。


    产品组分

    编号

    组分

    产品编号/规格

    40747ES76   (500T)

    40747ES80   (1000T)

    40747-A

    Calcein-AM Solution (2 mM)

    50μL

    50μL×2

    40747-B

    PI Solution(1.5 mM)

    150μL

    150μL×2

    40747-C

    10×Assay Buffer

    50mL

    100mL


    运输和保存方法

    冰袋运输;其中A组分和B组分需-20℃避光干燥保存,C组分-20℃保存,经常使用可放在4℃保存。一年有效。


    使用方法

    1. 工作液的配制

    1.1 1×Assay Buffer(反应缓冲液)的配制

    从低温冰箱内取出10×Assay Buffer,根据单次用量无菌条件取出适量,用去离子水(dH2O)做10倍稀释以得到1×Assay Buffer。

    1.2 1×染色工作液的配制

    1)先将低温保存的Calcein-AM溶液 (2 mM)和PI溶液(1.5 mM)回到室温20-30 min。
    意:第一次使用可对母液进行分装,以减少反复冻融次数。 

    2)取5 µL Calcein-AM溶液 (2 mM)和15µL PI溶液(1.5 mM)加入5 mL 1×Assay Buffer,充分混匀。此时得到Calcein-AM的工作液浓度为2 μM,PI的工作液浓度为4.5 μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同,初次实验建议做梯度实验,以确定 Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
    注意:由于Calcein-AM的稳定性比较差,此染色工作液必须现配现用,并且在当天用完。

    2. 染色步骤

    2.1  对于贴壁细胞,先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA消化细胞,之后离心收集细胞(1000 rpm,3 min)。

    对于悬浮细胞,直接离心(1000 rpm,3 min)收集细胞。

    2.2  去上清,用1×Assay Buffer充分清洗细胞2~3次,以充分去除残留的酯酶活性。

    2.3  用1×Assay Buffer制备细胞悬液,使其密度为1×105~1×106细胞/mL。

    2.4  取100 µL染色工作液加入200 µL细胞悬液内,混匀,37℃孵育15 min。
    注意:如果需要,可延长孵育时间至30min。

    2.5  荧光显微镜下使用490±10 nm激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)以及死细胞(红色荧光)。另外,使用545 nm的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
    注意:可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。

    a)用0.1%皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10 min,或者用70%乙醇孵育细胞30 min,从而制备死细胞;

    b)用0.1-10 µM的PI溶液进行死细胞染色,以得到仅仅对细胞核染色,而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。

    c)用0.1-10 µM的Calcein-AM进行死细胞染色,以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色,去观察是否活细胞能被染色。


    注意事项

    1)由于Calcein-AM对湿度非常敏感,若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后,必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。Calcein-AM工作液必须现配现用。

    2)碘化丙啶(PI)有一定的致癌性,操作时一定要注意防护。若接触到皮肤,需要立即用自来水清洗。

    3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


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