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巨噬细胞清除剂——氯膦酸盐脂质体


GUIDE

 导  读


巨噬细胞的清除,是全面了解巨噬细胞在病理条件下功能的一种十分有力的研究方法,氯膦酸盐脂质体(Clodronate Liposomes)是目前最为成熟,方便,经济的一种巨噬细胞清除工具,可以有效的清除动物体内不同组织部位和血液中的巨噬细胞。




氯膦酸盐脂质体组成及原理



氯膦酸二钠(Clodronate)是一种双膦酸盐药物,在临床上主要用于癌症引起的溶骨性骨转移、骨质疏松症和高钙血症。其作用机理是氯膦酸二钠在细胞内代谢成不可水解的ATP类似物,抑制线粒体中的ADP/ATP转运机制,从而阻断线粒体呼吸链诱导细胞凋亡。但是该药物亲脂性低,不能跨细胞转运,在口服或是静脉给予游离药物后,2小时后即可达半衰期,48小时内80%药物随尿液排出。

脂质体是单层或多层脂质双分子层的球形囊泡,其主要成分是磷脂和胆固醇。脂质体本身具有双分子层结构,组成成分无毒性,因此可以作为运输分子物质的载体,它通过与细胞膜结合的方式将分子物质运输到细胞内。


图1:氯膦酸-脂质体(Clodronate liposomes)复合物.jpg

图1:氯膦酸-脂质体(Clodronate liposomes)复合物


氯膦酸盐包裹进磷脂体的水相中形成氯膦酸盐脂质体,氯膦酸盐不能自由的通过脂质体磷脂体双分子层。注射到生物体内后,氯膦酸盐脂质体会被巨噬细胞吞噬,在巨噬细胞内的溶酶体磷酸酶的作用下,溶解在脂质体内的氯膦酸盐会被逐步释放出来并在细胞内积累,当达到一定浓度时,巨噬细胞将会受到不可逆损伤,诱发细胞凋亡。死亡细胞内的氯膦酸盐会被释放到细胞外,随尿液排出体外。


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图2:巨噬细胞清除剂原理示意图



产品性质



1 mL脂质体体悬液中所含的氯膦酸大约为5 mg,脂质体直径为1.5-2μm。所用的磷酸盐缓冲液为10 mM Na2HPO4,10 mM NaH2PO4,140 mM NaCl。



使用要点



» 必须使用无菌操作从小瓶中取出产品,如果无菌性受损,请勿使用。

» 当静置超过几个小时后,脂质体可能会沉淀,在使用之前,为了确保脂质体悬浮液均匀,缓慢倒转小瓶数次,直到悬浮液均匀,不要剧烈摇晃或震动。

» 在注射氯膦酸脂质体后数小时内,动物免疫能力开始下降,注意动物健康状况,以防止与实验无关的感染。

» 如果研究使用免疫缺陷小鼠预计会有很高的死亡率。

» 静脉给药时,请将药物加热至室温(18 ℃),并去除注射器中的气泡,缓慢注射,如果动物表现出任何异常反应,请降低注射速度。

» 脂质体应保存在4 °C,切勿冷冻。



体内注射方案(仅供参考)



尾静脉注射方法:

» 将小鼠固定,拉出尾巴,小鼠的尾部有2条动脉和3条静脉,2条动脉分别在尾部的背侧面和腹侧面,3条静脉呈品字型分布,一般采用左右两侧的静脉;

» 将纱布浸泡于约70 ℃温水中,拿出后包裹尾巴,使尾部血管扩张并软化表皮角质;

» 尾部静脉注射时,以左手拇指和食指前后摁住鼠尾,留出约2 cm一段,使皮肤紧张,静脉更为充盈,右手持1 mL针头注射器,使针头与静脉平行(小于30°角),从尾巴的下1/4处进针。开始注入药物时应缓慢,仔细观察,如果无阻力,无白色皮丘出现,说明已刺入血管,可正式注入药物。

» 如需连续尾静脉注射给药,注射部位应尽可能从尾端开始,按次序向尾根部移动,更换血管位置注射给药。拔出针头后,用棉球按住注射部位轻压1-2 min,止血。

【注】:以上操作方法和剂量使用仅供参考,不同的实验请自行设计实验方案或是参考相关文献。




效果展示



参考案例一 »



图3: 左图是正常小鼠肝脏免疫细胞中Kupffer细胞的比例.jpg

图3: 左图是正常小鼠肝脏免疫细胞中Kupffer细胞的比例,右图是注射Clodronate Liposomes 48小时后Kupffer细胞的比例,可以看到Kupffer细胞基本被清除[1]



参考案例二 »


图4: 上图是小鼠LLC细胞肺癌成瘤实验中正常肿瘤组织中的巨噬细胞(红色荧光).jpg

图4: 上图是小鼠LLC细胞肺癌成瘤实验中正常肿瘤组织中的巨噬细胞(红色荧光),下图是气管灌注Clodronate Liposomes肿瘤组织中的巨噬细胞(红色荧光),可以看出肿瘤中的巨噬细胞基本被清除[2]



不同组织巨噬细胞清除的实验方法 »


靶向器官/细胞

实验方法

脾脏/红髓区巨噬细胞

单次给药:200 μL/小鼠(静脉注射或腹腔注射)

长期耗竭:第一次给药150 μL/小鼠,之后每隔两周给药100 μL/小鼠

肝脏/Kupffer细胞

单次给药:200 μL/小鼠(静脉注射或腹腔注射)

长期耗竭:第一次给药剂量150 μL/小鼠,以后按照两周一次给药100 μL/小鼠

肺/肺泡巨噬细胞

静脉注射(150-200 μL)联合气管或鼻内(50 μL)给药获得最佳效果

淋巴结

注射(100-200 μL)/小鼠,具体给药方式可参考文献

脑/小胶质细胞

脑室脑脊液注射,10 μL/小鼠,50 μL/大鼠

【注】:本剂量仅供参考,请根据实验需求使用或参考文献。



FAQ



Q1:收到Clodronate liposomes后该如何操作?

A:收到氯膦酸脂质体后,如果不能马上使用,需要放置在4 ℃冰箱。禁止冻存!使用时作为原液使用,不能进行稀释。脂质体很容易发生沉淀,建议使用之前轻轻混匀,另外4 ℃的氯膦酸脂质体不能马上使用,需要恢复到室温才能进行注射。

Q2:如何将脂质体从小瓶中转移出来?

A:从小瓶中转移脂质体的最佳方法是使用无菌针头注射器。这样小瓶中剩余的脂质体悬浮液就可以保持密封和清洁。您也可以使用带有无菌吸头的移液器进行转移,但最好在洁净的环境中进行,例如在BSC罩中。

Q3: Clodronate liposomes能否用于体外巨噬细胞清除?

A:产品可以用于体外巨噬细胞的清除,但是这种方法比较适合体内实验。主要是由于在体外培养过程中,从死亡细胞释放的氯膦酸或者是从脂质体中“渗漏”出来氯膦酸,会一直存在于培养基中,但是在体内,氯膦酸的半衰期很短,很快就会被肾脏清除。虽然游离的氯膦酸不会进入细胞也不会进入脂质体,但是一旦他们在培养基中积累就会慢慢地进入细胞中。

Q4:在静脉注射Clodronate liposomes后动物很快就死亡了,是什么原因?

A:一方面有可能是动物注射了不均一的脂质体悬液。建议在使用之前轻轻摇晃混匀。脂质体在体外一段时间后会发生沉降。如果在很长一段时间内需要一次注射多只动物,那么脂质体便会在注射器中发生沉淀,形成不均一悬液,这样一来,第一只注射的计量与最后一只注射的计量就会发生明显的变化。另外一方面有可能是脂质体刚从冰箱取出后,没有恢复到室温。

Q5:动物在注射Clodronate liposomes后几天就死亡了?

A:这个可能是受到细菌的污染,体内清除巨噬细胞后会增加例如病毒粒子,细菌或者酵母感染的几率。

Q6:静脉注射Clodronate liposomes后大鼠脾脏/肝脏中的ED1+细胞并没有完全消失?

A:大鼠中成熟的巨噬细胞呈现ED1和ED2双阳性,但是有一些没有吞噬功能的或者吞噬作用小的前体细胞也是ED1+,但是呈现ED2-。因此,所有ED2+的细胞都可以被完全清除,但是ED1+的细胞却只能被部分清除,清除的比率取决于前体/成熟巨噬细胞的比例。

Q7: Clodronate liposomes没有达到期望的效果?

A:氯膦酸脂质体都是大批量的生产,每批次都会对氯膦酸的浓度以及一些可能的污染物进行检测,确保无误后才会销售给客户。另外,脂质体容易收到极端温度的影响。正确的运输和储存方式是4~8 ℃,悬液既不能被冻存,也不能被加热超过30 ℃。自收到货物起,需要在3个月内使用完,不然有可能会影响使用的效果。

Q8:在静脉注射时,能不能增加注射的体积?

A:静脉注射时需要依据动物的体重,不能超过0.1 mL/10 mg,但是进行腹腔注射可以适当的增加注射的体积。皮下注射需要根据注射位点的容量进行决定。

Q9:使用脂质体应注意的一些事项?

A:通过具有饱和烃链的脂质制备而来的脂质体实际上非常坚固,但仍需要注意以下一些事项。

①不要与有机溶剂混合,如氯仿、甲醇、乙醇、DMSO、乙醚等。

②不要添加表面活性剂,除非您必须要这样做以裂解脂质体。

③不要加热、接近或高于脂质主相转变温度,除非进行药物加载,这需要在相变温度以上进行孵育。



产品订购



产品名称

货号

规格

价格(元)

Clodronate Liposomes(From Vrije Universiteit Amsterdam)体内巨噬细胞清除剂

40337ES08/10

5 mL/10 mL

3152/5132

Control Liposomes(PBS)体内巨噬细胞清除剂空白脂质体对照

40338ES05/10

5 mL/10 mL

1652/2252

Hematoxylin and Eosin Staining Kit 苏木素伊红(H&E)染色试剂盒

60524ES60

2×100 mL

358

Prussian Blue Iron Stain Kit普鲁士蓝染色试剂盒(铁染色)

60533ES20/60

20 T/100 T

388/1288



参考文献



[1]: Guan Z, Ding Y, Liu Y, Zhang Y, Zhao J, Li C, Li Z, Meng S. Extracellular gp96 is a crucial mediator for driving immune hyperactivation and liver damage. Sci Rep. 2020 Jul 28;10(1):12596. doi: 10.1038/s41598-020-69517-7. PMID: 32724151; PMCID: PMC7387550.

[2]: Li R, Yang L, Jiang N, Wang F, Zhang P, Zhou R, Zhang J. Activated macrophages are crucial during acute PM2.5 exposure-induced angiogenesis in lung cancer. Oncol Lett. 2020 Jan;19(1):725-734. doi: 10.3892/ol.2019.11133. Epub 2019 Nov 21. PMID: 31897188; PMCID: PMC6924157.