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提取+建库!FFPE样本文库制备一站式解决方案!

肿瘤样本是检测基因突变的载体,世界肿瘤发病率居高不下,而医院的低温储存设备捉襟见肘,福尔马林浸泡,石蜡包埋的样本(FFPE)能在常温长时间储存,更受广大临床医生欢迎。据统计,世界各地医院积攒了约4亿FFPE样本,但是福尔马林的固定、石蜡高温浸入、较长保存时间都会导致DNA的交联和不同程度降解,如何从这些海量样本中提取高质量DNA,然后建库测序并分析成为了棘手问题。翌圣生物深耕生命科学领域多年,基于自身深厚的工具酶技术和经验积累,为FFPE DNA的NGS检测提供完整解决方案。


图1.FFPE DNA实验、分析.jpg

图1. FFPE DNA实验、分析


FFPE DNA提取


FFPE DNA提取需经历脱蜡、酶消化、DNA提取共3个步骤。经过潜心优化和精心打磨,翌圣重磅推出FFPE DNA提取试剂盒——MolPure® Magnetic FFPE DNA Kit(鄂汉械备20210919号)。在FFPE脱蜡步骤中,目前市场上常用的脱蜡方式是二甲苯,其强烈刺激性气味,强烈刺激人体食道和胃,并引起呕吐,本试剂盒采用无毒脱蜡液取代二甲苯脱蜡功效,为实验人员健康保驾护航;在酶消化步骤中,翌圣采用精心优化提取体系,确保蛋白酶K能充分消化蛋白和相应核酸酶,保证DNA最大程度释放和不被核酸酶消化,这一点直接体现在最终DNA产量上面。结果显示,翌圣提取总量最高。


图2 各试剂盒提取FFPE DNA结果.jpg

图2. 各试剂盒提取FFPE DNA结果

在DNA提取步骤中,传统的手段有酚氯仿抽提、柱膜法、磁珠法,基于未来大样本量自动化应用场景考量,翌圣采用独家磁珠混合液,操作简便,保证提取DNA纯度,且完美兼容自动化核酸提取仪,大幅提升大样本量FFPE DNA提取效率。


FFPE DNA文库构建



 1   酶切法建库

FFPE DNA一般需要打断才能建库和机械法打断相比,酶切法更温和更高效,对片段损伤更小,且不需要专门打断仪器和耗材,降低了实验成本。针对不同测序平台,翌圣均布局了酶切建库解决方案,助力客户简单高效进行建库实验。针对Illumina平台,翌圣推出Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina®,采用最新优化的连接酶、最新型高保真酶,改善接头连接时的片段自连并进一步提升扩增的均一性和保真性,持续提升测序结果质量。针对日益普及的MGI平台,翌圣推出Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI®酶切法),满足客户对不同测序平台建库需求。

33333333.jpg

图3. 文库产出(50ng FFPE DNA)

 图4 文库测序下机结果.jpg

图4.文库测序下机结果


 2   建库接头

建库完成后的混样测序中,index(或称barcode)是区分各个样本的“身份证”,通常只有几个碱基差异,而实验操作引入的index污染、PCR扩增误差、测序扩增误差均造成标签跳跃 (index hopping),单端index长接头、双端组合接头CDI(Combinational Dual Index)在区分测序样本来源能力较为薄弱。针对这个测序中频发的难题,在illumina和MGI测序平台,翌圣均布局双端特异性接头UDI(Unique Dual Index产品,例如,Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®双端特异性接头多达384种,完全满足检测需求。结合文库QC,保证低污染的文库进行混样和测序,将大幅降低index hopping带来的实验困扰,助您实验无忧。

图5. UDI识别index hopping的原理.jpg

图5. UDI识别index hopping的原理


 3   DNA磁珠

磁珠纯化是建库关键环节之一,Hieff NGS® DNA Selection Beads基于SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization)原理,通过精心优化过的缓冲体系,可用于DNA文库片段分选、纯化,和目前广泛使用的AMPure XP Beads使用方式相同,片段回收效率和文库大小分布均高度吻合,因此可无缝替代AMPure XP Beads,有效降低建库成本。

表1.不同品牌磁珠在不同比例下回收效率比较

磁珠比例

Input DNA (ng)

Yeasen

Be*

Va*

Vd*

Tr*

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

1.8×

535

534.4

99.89%

524.8

98.09%

518.4

96.90%

566.4

105.87%*

534.4

99.89%

1.2×

518.4

96.90%

537.6

100.49%*

521.6

97.50%

528

98.69%

505.6

94.50%

0.8×

499.2

93.31%

406.4

75.96%

416

77.76%

464

86.73%

425.6

79.55%

0.6×

326.4

61.01%

210.56

39.36%

281.6

52.64%

283.52

52.99%

247.04

46.18%

【注】:DNA Marker中含loading等物质,影响核酸定量,因而初始的Input定量结果偏低,所以表中出现回收效率略高于100%。


 4   文库定量

核酸定量在NGS实验流程很常见。Qubit常用于提取DNA和文库初步定量,翌圣推出dsDNA HS Assay Kit for Qubit®可实现0.2-100 ng双链DNA(dsDNA)快速、精确的定量,操作简单,结果可靠,同时为了进一步提高实验便捷性,亦可提供预混液版本定量试剂;此外因为文库纯化后可能存在一定接头互联、为连接接头的双链DNA,若采用Qubit定量文库可能会虚高,所以针对文库精准定量,翌圣推出Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®扩增引物对根据Illumina文库接头序列P5和P7设计,可保证特异性扩增双端接头完整的文库分子,从而实现Illumina文库精准定量。

稳定性检测.jpg

精准度分析.jpg

图6.Qubit定量稳定性与精确性对比 

随着国内基于NGS技术的基因测序市场的持续发展,翌圣生物将会根据客户需求推出基于NGS检测的全流程解决方案,加速推进国产试剂的替换进程,帮助客户创造价值,让世界更健康更快乐。


订购信息



产品名称

产品编号

规格

MolPure® Magnetic FFPE DNA Kit  磁珠法FFPE DNA提取试剂盒

18371ES50

50T

Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina® DNA 酶切法建库试剂盒

12205ES24

12205ES96

24T

96T

Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit for MGI® DNA 酶切法建库试剂盒

13322ES16

13322ES96

16T

96T

Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®  UDI接头

12404ES01

12405ES01

12406ES01

12407ES01

12×2T

96×2T

192×1T

384×1 T

Hieff NGS® Unique Dual Index Primer Kit for MGI® Set 1

13451ES02

13451ES04

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS® Unique Dual Index Primer Kit for MGI® Set 2

13452ES02

13452ES04

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS® Unique Dual Index Primer Kit for MGI® Set 3

13453ES02

13453ES04

 

 

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS® Unique Dual Index Primer Kit for MGI® Set 4

13454ES02

13454ES04

48×2 T

48×4 T

Hieff NGS® DNA Selection Beads 分选磁珠

12601ES08

12601ES56

12601ES75

5mL

60mL

450mL

dsDNA HS Assay Kit for Qubit®  Qubit试剂

12640ES60

12640ES76

100T

500T

1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®  Qubit预混液

12642ES60

12642ES76

100T

500T

Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master MixqPCR文库定量

12302ES05

500T

Hieff NGS® Library dilution buffer 文库稀释液 

12303ES50

50 mL

Hieff NGS®Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard 1-6  qPCR标准品

12307ES09

6×96μL