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400-6111-883
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400-6111-883
Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒
产品货号:40310ES20
产品规格:20 T
产品价格:¥480.00
类别:细胞凋亡与吞噬

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  • 产品信息


    产品名称

    产品编号

    规格

    储存

    价格(元)

    Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit

    Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

    40310ES20

    20 T

    4℃避光保存

    480.00

    40310ES50

    50 T

    4℃避光保存

    960.00

    40310ES60

    100 T

    4℃避光保存

    1680.00


    产品描述

    Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒是用红色荧光染料PE(Phycoerythrin)标记的Annexin V作为探针,来检测细胞早期凋亡的发生,可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。

    其检测原理为:在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

    另外,本试剂盒中提供的7-AAD可用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。7-AAD是一种核酸染料,同PI有着相似的荧光特性,但其发射光谱较PI窄,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI的最佳替代品,可与Annexin V联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将Annexin V-PE7-AAD联合使用时,7-AAD则被排除在活细胞(Annexin V-/7-AAD-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/7-AAD-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Annexin V-PE7-AAD结合染色呈现双阳性(Annexin V+/7-AAD+)。


    产品组分

    编号

    组分名称

    产品编号/规格

    40310ES2020T

    40310ES5050T

    40310ES60100T

    40310-A

    重组人Annexin V/PE*(rh Annexin V/PE)

    100µL

    250µL

    500µL

    40310-B

    7-AAD Viability Staining Solution(20µg/mL

    200µL

    500µL

    1.0mL

    40310-C

    4×Binding Buffer**

    4mL

    10mL

    20mL

    *来源于大肠杆菌(E.coli),分子量为35.8 KDa,纯度>98%(SDS-PAGE&HPLC)


    运输与保存方法

    冰袋(wet ice)运输。本试剂盒所有组分均在4保存,勿冰冻Annexin V-PE、7-AAD需避光保存。一年有效。


    注意事项

    1)剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。

    2)由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。

    3)对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,7-AAD摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-PE的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后,轻摇时胰酶与细胞充分接触,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

    4)如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并低速离心200×g)洗去血小板,然后用Annexin V结合缓冲液清洗细胞,以避免残留的EDTA会螯合Ca2+

    5)7-AAD为潜在致癌物,操作时请采取防护措施,穿防护服、戴手套等

    6)Annexin V-PE7-AAD是光敏物质,在操作时请注意避光。


    使用说明

    1 样品染色

    1) 悬浮细胞:300 g,4离心5 min收集细胞。

    贴壁细胞:用不含EDTA的胰酶消化后,300g,4离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长,以防引起假阳性。

    2)配制1×Binding Buffer:用去离子水4倍稀释4×Binding Buffer4 mL 结合缓冲液+12 mL 去离子水)

    3)4℃预冷的PBS洗涤细胞2次,每次均需300 g,4离心5 min。

    4)加入250 μL 1×Binding Buffer重悬细胞,调节其浓度为1×106细胞/mL

    5)100 μL细胞悬液于5mL流式管中,加入5 μL Annexin V/PE10 μL 7-AAD,轻轻混匀。

    6)避光、室温反应15 min。

    7)加入400 μL 1×Binding Buffer,混匀,样品在1小时内检测。

    注:为了避免洗涤细胞时损失细胞,在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

    2 观察检测

    A、流式细胞仪分析

    1)用流式细胞仪检测,激发波长Ex=488nm;发射波长Em=578 nm,Annexin V-PE的橙红色荧光建议使用FL2通道检测;激发波长Ex=546 nm;发射波长Em=647 nm,7-AAD红色荧光建议使用FL3通道检测CellQuest等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),PE为横坐标,7-AAD为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型的实验中,细胞可以分成三个亚群,活细胞仅很低强度的背景荧光,早期凋亡细胞仅较强的橙红色荧光,晚期凋亡细胞呈橙红和红色荧光双重染色。

    2)荧光补偿调节:使用未经凋亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。

    B、荧光显微镜观察

    1)滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞;

    2)对于贴壁细胞来说,也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡;

    a 将细胞于盖玻片上生长,用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并设立阴性对照组;

    b 用PBS洗涤细胞两次;

    c 在500 μLBinding Buffer 中加入1 μL Annexin V-PE,5 μL 7-AAD染液混匀;

    d 将上述溶液滴加于盖玻片表面,使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖;

    e 室温避光孵育5 min。

    3)将盖玻片倒置于载玻片上,在荧光显微镜下用双色滤光片观察。滤光片(罗丹明)观察Annexin V-PE 荧光信号呈橙红色;用激发波长546 nm,发射波长647 nm,观察7-AAD荧光信号呈红色。


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    HB181206