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Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng)
产品货号:12206ES08
产品规格:8 libraries
产品价格:¥1355.00
类别:DNA-Seq

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  • 产品信息


    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng)

    12206ES08

    8 T

    1355.00

    12206ES24

    24 T

    6155.00

    12206ES96

    96 T

    23855.00



    产品描述

    Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng)是针对lllumina®高通量测序平台专业开发设计的转座酶法建库试剂盒,适用于1 ng的基因组DNAcDNA、扩增子(>500 bp)等样本的建库。与常规分步法建库相比,Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®采用新型转座酶和优化的缓冲体系,仅需10 min即可完成DNA片段化、末端修复和接头连接过程,显著缩短建库时间至1.5小时以内,并获得优异的测序质量。此外,本试剂盒已经不同GC含量DNA样本的验证,无偏好性或仅具有极低的偏好性。本试剂盒提供的所有试剂盒组分,都经过严格的质量与功能验证,最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。


    产品组分

    组分编号

    组分名称

    8 libraies

    24 libraies

    96 libraies

    12206-A

    5×Reaction Buffer

    80 μL

    240 μL

    960 μL

    12206-B

    Transposome Mix V1

    40 μL

    120 μL

    480 μL

    12206-C

    6×Terminate Solution

    80 μL

    240 μL

    960 μL

    12206-D

    PCR Primer Mix

    24 μL

    72 μL

    288 μL

    12206-E

    2×Super Canace Mix

    200 μL

    600 μL

    2400 μL

    12206-F

    N5 (N501)*

    8 μL

    ——

    ——

    12206-G

    N7 (N701)*

    4 μL

    ——

    ——

    12206-H

    N7 (N702)*

    4 μL

    ——

    ——


    注意:
    *测序时Index序列N501-TAGATCGCN701-TAAGGCGAN702-CGTACTAG


    运输与保存方法

    冰袋运输。所有组分-20°C保存,有效期1年。


    注意事项

    一、关于操作

    1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

    3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打或轻轻振荡混匀,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

    4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。试剂吸取时应保证枪头适当深入液体,排出时应确认枪头无残留。

    5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

    6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用专用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。

     

    二、关于产品原理

    本产品基于转座酶法开发,其核心原理是转座酶及其转座机制。在Transposome Mix中包含由转座酶和两种等摩尔的接头Adapter 1Adapter 2构成一个完整的转座子。转座发生时,该转座子将Adapter 1Adapter 2接头序列插入靶基因中,形成一端带有Adapter 1,一端带有Adapter 2DNA,之后利用DNA聚合酶将转座形成的切口补齐。这种产物经N5N5XX)和N7N7XX)以及P5P7PCR Primer Mix)两对引物扩增,产物经分选和纯化后即为可测序文库。

    image.png

    1  Fast Tagment DNA建库试剂盒原理

    三、关于DNA片段化(DNA Tagment

    1. 本试剂盒使用转座酶进行DNA片段化。如DNA样品为PCR产物,应保证其长度>500 bp。因转座酶无法作用于DNA末端,因此PCR产物最末端50 bp测序覆盖度可能会有所降低。我们推荐您在制备PCR产物时将待测区域两末端各延长50-100 bp,以避免末端测序覆盖度降低的情况。

    2. 本试剂盒适用1 ng Input DNA。在Input DNA投入前,应将其纯化并溶于灭菌蒸馏水中,A260/A280 = 1.8-2.0,并使用基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®PicoGreen®等进行定量。【注意:因Transposome MixDNA浓度非常敏感,所以准确的DNA浓度测定对实验成功与否至关重要。】


    四、关于磁珠纯化与分选(
    Bead-based Clean Up and Size Selection

    1. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

    2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

    3. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

    4. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

    5. 磁珠使用过程中,应保证移液准确性。

    6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

    7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存1周,-20°C可保存1个月。


    五、关于文库扩增(
    Library Amplification

    1. 使用本试剂盒必须进行文库扩增步骤。因转座反应产物并非完整的双链DNA文库,必须通过PCR反应生成完整的DNA文库。

    2. Input DNA量为1 ng时,推荐使用8-15个扩增循环,13个循环的文库产出约为600 ng


    六、关于文库质检(
    Library Quality Analysis

    1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

    2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。

    3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

    4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

    5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。


    使用方法

    一、自备材料

    1. 纯化磁珠:Cat#12601Hieff NGS® DNA Selection BeadsCat#A63880AMPure XP Beads或其他等效产品。

    2. 文库质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

    3. N5N5XX)和N7N7XXIndex引物: Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)Cat#12610ES96)。

    4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer10 mM Tris-HClpH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。


    二、操作流程

           image.png

    2  Fast Tagment DNA建库试剂盒操作流程

    三、操作步骤

    3.1 DNA片段化(DNA Tagment

    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。将5×Reaction Buffer6×Terminate Solution室温解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于无菌PCR管中配制表1所示反应体系。

    片段化反应体系

    名称

    体积(μL

    1 ng   Input DNA

    x

    5×Reaction   Buffer

    10

    Transposome   Mix V1

    5

    ddH2O

    Up to   50 μL

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

    4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表2所示反应程序,进行片段化反应。

     

    片段化反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    On

    55°C

    10 min

    4°C

    Hold

    5. 终止反应:立即向反应物中加入10 μL 6×Terminate Solution,使用移液器轻轻吹打混匀,短暂离心,55℃反应10 min,如表3

    终止反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    On

    55°C

    10 min

    4°C

    Hold

    6. 片段化产物纯化

    1)将平衡至室温的Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠,振荡或上下颠倒混匀,以1.0×比例回收上述片段化产物。

    2)吸取60 μL磁珠加入上述60 μL片段化产物中,使用移液枪轻轻吹打混匀,室温孵育5 min

    3)将PCR管短暂离心并置于磁力架上分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    4)保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后小心移除上清。

       5)重复步骤4),总计漂洗两次。

       6)保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。
       7)将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置孵育5 min
       8)将反应管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清(约5 min)后小心吸取20 μL上清至干净的灭菌PCR管中。
    7. 立即进行步骤3.2,文库PCR富集。


    3.2
    文库扩增(Library Amplification

    1. 将表4中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于无菌PCR管中配制表4所示反应体系。

    4  PCR扩增反应体系

    名称

    体积(μL

    步骤三纯化产物

    20

    PCR   Primer Mix

    3

    N5XX*

    1

    N7XX*

    1

    2×Super   Canace Mix

    25

    ddH2O

    Up to   50 μL


    注意:
    *Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)Cat#12610ES96)中提供8N5XX12N7XX,可根据样品数量和Index选择策略自行选择。

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    4. PCR管置于PCR仪中,设置表5所示反应程序,进行PCR扩增。  

      

    5  PCR扩增反应程序

    温度

    时间

    循环数

    热盖105°C

    On

    ——

    72°C

    3 min*

    ——

    95°C

    30 sec

    ——

    95°C


    10 sec

    n   cycles**

    55°C

    30 sec

    72°C

    30 sec

    72°C

    5 min

    ——

    4°C

    Hold

    ——


    注意:
    *此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链DNA72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

    **循环数请根据测序需要进行选择。起始DNA量为1 ng时,推荐8-15个扩增循环。


    3.3
    文库纯化或分选(Library Clean UP/Size Selection

    如对文库长度分布无特殊要求,可直接使用1.0×磁珠纯化扩增产物(参照步骤3.16.片段化产物纯化步骤),而不进行片段分选。如需进行片段分选,则进行以下步骤,推荐使用Cat#12601 DNA Selection Beads进行产物片段分选,为防止接头或大片段残留,可进行两次片段分选,或先使用1.0×磁珠纯化扩增产物后再进行分选。

    1. 将平衡至室温的Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠,振荡或上下颠倒混匀。

    2. 根据DNA片段长度要求,进行双轮分选时,需将初始DNA样本用灭菌蒸馏水补齐至100 μL,参考表6推荐比例向文库上清中加入第一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温孵育5 min。【注意:因PCR过程中样品挥发会导致产物体积不足50 μL,进行下面操作之前必须使用灭菌蒸馏水将体积补齐至100 μL,否则分选长度会与预期不一致。】

    磁珠文库分选推荐比例

    文库平均总长度

    ~300 bp

    ~400 bp

    ~500 bp

    ~800 bp

    第一轮磁珠用量

    80 μL   (0.8×)

    70 μL   (0.7×)

    60 μL   (0.6×)

    50 μL   (0.5×)

    第二轮磁珠用量

    20 μL   (0.2×)

    20 μL   (0.2×)

    20 μL   (0.2×)

    15 μL   (0.15×)

    注意:“×”数均根据PCR产物体积补齐至100 μL计算而得,如“0.6×”表示0.6×100 μL = 60 μL

    3. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。

    4. 参考表6向上清中加入第二轮分选磁珠。

    5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min

    6. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    7. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

    8. 重复步骤7,总计漂洗两次。

    9. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

    10. PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min

    11. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中,于-20℃保存。此外,如需获得长度分布更集中的文库扩增产物,可使用胶回收方式进行长度分选和纯化;如对文库长度分布范围等无特殊要求,扩增产物也可不进行长度分选,直接使用磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化。


    3.4
    文库质量控制

    通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。


    3.5
    参考实例

    使用Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina®1 ng嗜盐杆菌gDNA样本建库,并分别使用1.0×磁珠进行纯化,0.8×/0.2×0.7×/0.2×0.5×/0.15×磁珠比例进行长度分选,结果使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

    image.png

    3  Agilent 2100 Bioanalyzer文库质量分析


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    12600ES03/08/56/75

    5/60 mL

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    12601ES03/08/56/75

    5/60 mL

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    12×4/12×16 T

    1256/4536

    Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2

    12616ES04/16

    12×4/12×16 T

    1256/4536

    Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3

    12617ES04/16

    12×4/12×16 T

    1256/4536

    Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4

    12618ES04/16

    12×4/12×16 T

    1256/4536

    Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®,(96 Index)

    12610ES96

    96 T

    1365

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    规格

    价格(元)

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