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Hieff NGS® MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina® MaxUp mRNA 建库试剂盒
产品货号:12301ES08
产品规格:8 T
产品价格:¥2826.00
类别:RNA-Seq

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff NGS® MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina®

    MaxUp mRNA 建库试剂盒

    12301ES08

    8 T

    2826.00

    12301ES24

    24 T

    9756.00

    12301ES96

    96 T

    32856.00

    产品描述

    Hieff NGS® MaxUp Dual-model mRNA Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒,本试剂盒cDNA二链合成模块配有两种buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-1μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、链双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增,总RNA样品最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。

    试剂盒包含三个独立模块,BOX-I的核心为纯化mRNA所需的poly(A)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性dscDNA合成所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP,使cDNA第二链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异性。BOX-III实际上是一个高效的微量DNA文库构建试剂盒,来自我公司的Hieff NGS® MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina®。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。


    产品组分

    组分编号和名称

    12301ES08

    12301ES24

    12301ES96

    BOX-I

    12603-A

    mRNA Capture Beads

    0.4 mL

    1.2 mL

    4.8 mL

    12603-B

    Bead Binding Buffer

    0.4 mL

    1.2 mL

    4.8 mL

    12603-C

    Beads Wash Buffer

    5 mL

    15 mL

    60 mL

    12603-D

    Tris Buffer

    0.4 mL

    1.2 mL

    4.8 mL

    BOX-II

    12250-A

    Frag/Prime Buffer

    150 μL

    450 μL

    900 μL×2

    12250-B

    1st Strand Synthesis Enzyme Mix

    16 μL

    48 μL

    192 μL

    12250-C

    Strand Specificity Reagent

    50 μL

    150 μL

    580 μL

    12250-D

    2nd Strand Synthesis Buffer (with dNTP)

    162 μL

    485 μL

    965 μL×2

    12250-E

    2nd Strand Synthesis Buffer (with dUTP)

    162 μL

    485 μL

    965 μL×2

    12250-F

    2nd Strand Synthesis Enzyme Mix

    41 μL

    121 μL

    482 μL

    BOX-III

    12200-A

    Endprep Buffer

    48 μL

    144 μL

    576 μL

    12200-B

    Endprep Enzyme

    32 μL

    96 μL

    384 μL

    12200-C

    Ligation Enhancer

    240 μL

    720 μL

    4×720 μL

    12200-D

    Quick T4 DNA Ligase

    40 μL

    120 μL

    480 μL

    12200-E

    2× Super Canace® II High-Fidelity Mix

    200 μL

    600 μL

    4×600 μL

    12200-F

    Primer Mix

    40 μL

    120 μL

    480 μL


    运输与保存方法

    冰袋运输。效期一年。存储温度如下,切不可搞错!

    Box I:2-8保存Box II:-20保存Box III:-20保存


    注意事项

    一、 关于操作

    1.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

    3.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
    4.请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
    5.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。

    二、应用范围

    本试剂盒适用于起始模板量为10-1000 ng(体积≤50 μL)的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低,体积超过50 μL,可使用Hieff NGS® RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测,RIN值要求>7,以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。

    本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo d(T)磁珠,只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的mRNA,如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外,FFPE样本中的mRNA降解严重,通常无完整的poly(A)尾结构,故亦无法使用本试剂盒进行建库。

    本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用,包括:

    基因表达(gene expression)

    单核苷酸变异检测(single nucleotide variation discovery)

    基因融合鉴定(gene fusion identification)

    剪切变异体分析(splice variant analysis)

    三、关于接头连接(Adapter Ligation)

    1.本试剂盒推荐使用短接头(也称为小Y接头、不完整接头)进行建库,目前我公司可提供单端 96种 Index Kit 和双端 384 种 Index Kit。

    单端 96 种 Index Kit:Cat#12611,Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina® , Set 1(48 种); Cat#12612,Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 2(48 种)。

    双端 384 种 Index Kit:Cat#12613,Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 1(96 种); Cat#12614,Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 2(96 种)。

    2.我们建议选用高质量的商业化接头,如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。

    3.使用接头时,请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻;在室温操作时,实验室温度最好不要超过25°C,防止接头解链。

    4.建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。

     

    1 Input Total RNA量与接头浓度推荐表

    Input Total RNA

    Adapter stock concentration

    10–100 ng

    0.15 μM

    100–499 ng

    1.5 μM

    500–1000 ng

    5 μM

     

    四、关于磁珠纯化与分选(Beads-based Clean Up and Size Selection)

    1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

    2.磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

    3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

    4.转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

    5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

    6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

    7.DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存1周,-20°C可保存1个月。

    五、关于文库扩增(Library Amplification)

    1.本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。

    2.如果您使用barcoded adapter(也成为长接头、大Y接头),可使用本试剂盒提供的引物Primer mix进行扩增;如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”,则需要使用index primers进行扩增,加上相应的barcodes。

    3.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。

    2 Input Total RNA量与扩增循环数推荐表*

    Input Total RNA

    Number of cycles

    10 ng

    15–16

    100 ng

    12-14

    1000 ng

    8–10

    【注】:*如使用链特异性文库构建方案,产量会相对减少,故选择高的循环数;否则,低循环数已经足够获得测序文库。当使用的总RNA质量较差时,可适当增加1-2循环。

    六、关于文库质检(Library Quality Analysis)

    1.通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

    2.文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。

    3.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

    4.文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

    5.文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

    使用方法

    一、自备材料

    1.纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)或AMPure XP Beads(Cat#A63880)或其他等效产品。

    2.RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

    3.Adapters:barcoded adapter(长接头)或者无barcode的短接头试剂盒。

    4.文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

    5.其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

    二、操作流程

    image.png 

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    1 mRNA建库试剂盒操作流程

    三、操作步骤

    3.1 mRNA纯化和片段化mRNA Purification and Fragmentation)

    1.将mRNA Capture Beads从2-8取出,静置使其温度平衡至室温,约30 min。

    2.准备一个Nuclease free离心管,将0.01-1 μg总RNA溶解至50 μL Nuclease free水中,冰上放置备用。

    3.颠倒或旋涡振荡混匀磁珠,吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中,用移液器吹打6次,使其充分混匀。

    4.将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中,655 min;4hold,使得RNA变性。

    5.室温孵育5 min,使mRNA与磁珠完全结合。

    6.将样品置于磁力架中,室温静置5 min,使mRNA与总RNA分离,小心移除上清。

    7.将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中,

    室温静置5 min,小心移除上清。

    8.重复步骤7,共洗涤两次。

    9.将样品从磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

    10.将样品置于PCR仪中,802 min;25hold,将mRNA洗脱下来。

    11.加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

    12.室温放置5 min,使mRNA结合到磁珠上。

    13.将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。

    14.将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀,将样品重新放回至磁力架中,室温静置5 min,吸掉全部上清。

    【注】:最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。

    15.将样品从磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠,用移液器吹打6次以彻底混匀;将样品置于PCR仪中(预设为94℃),根据插入片段大小的需要,可参考表3选择片段化程序,但不同物种片段化的效果有差异,客户可先根据自己的情况,做个片段化时间的梯度,比如5、10、15 min。等合成双链cDNA后,使用Agilent 2100分析大小

    3 mRNA片段化程序选择

    插入片段大小(bp)

    打断程序

    Hold

    150-200

    94°C,10~15 min;

    4°C

    200-300

    94°C,~10 min;

    4°C

    300~400

    94°C,~8 min;

    4°C

    400-700

    94°C,~6 min

    4°C

    16. 片段化程序结束后,立即将样品置于磁力架中,转移17 μL上清至一个新的nuclease free离心管中,立刻进入第一链合成反应。

    3.2 双链cDNA的合成与纯化(cDNA Synthesis and Purification)

    第一链cDNA的合成:

    1. 将1st Strand Synthesis Reaction Buffer从-20°C取出,解冻后颠倒混匀。按表4所示,配制第一链cDNA合成的反应液

    4 第一链cDNA合成反应体系

    名称

    体积(μL)

    Fragmented mRNA

    17

    Strand Specificity Reagent

    6

    1st Strand Synthesis Enzyme Mix

    2

    2. 使用移液器轻轻吹打或涡旋震荡混匀,瞬离将反应液离心至管底。

    3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表5所示设置反应程序,进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

    5  第一链cDNA合成反应程序

    温度

    时间

    热盖 105°C

    On

    25°C

    10 min

    42°C

    15 min

    70°C

    15 min

    4°C

    Hold

    第二链cDNA的合成

    1. 将2nd Strand Synthesis Buffer-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表6所示,配制第二链cDNA合成反应液。

    6  第二链cDNA合成反应体系

    名称

    体积(μL)

    1st Strand cDNA

    25 μL

    2nd Strand Synthesis Buffer (with dNTP or dUTP)*

    20 μL

    2nd Strand Synthesis Enzyme Mix

    5 μL

    【注】:*如构建普通mRNA文库,请使用含dNTP的buffer;如构建链特异性mRNA文库,请使用含dUTP的buffer。

    2. 使用移液器轻轻吹打或涡旋震荡混匀,瞬离将反应液离心至管底。

    3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表7所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。

    7  第二链cDNA合成反应程序

    温度

    时间

    热盖 105°C

    Off

    16°C

    1 h

    4°C

    Hold

    双链cDNA纯化:

    该步骤将对获得的双链cDNA进行纯化。

    1. 将Hieff NGS® DNA Selection Beads DNA (Cat#12601)提前30 min从2-8℃取出,室温静置使其温度平衡至室温。

    2. 颠倒或旋涡振荡使Hieff NGS® DNA Selection Beads充分混匀,吸取90 μL (1.8 ×)磁珠悬液加入到第二链cDNA样品(50 μL)中,涡旋振荡或使用移液器吹打使其充分混匀。

    3. 室温孵育5 min。

    4. 磁力架上静置5 min。待溶液澄清后,保持样品始终处于磁力架中,小心移除上清。

    5. 保持样品始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠(注意不要吹散磁珠),室温孵育30 sec,小心移除上清。

    6. 重复上一步,总计漂洗2次。

    7. 保持样品始终处于磁力架中,开盖空气干燥磁珠5 min。

    8. 将样品从磁力架中取出,加入51 μL nuclease free水,涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀,室温静置5 min。瞬离后在磁力架上静置5 min,待溶液澄清后,小心吸取50 μL上清至一个新的nuclease free离心管中。

    3.3 末端修复/dA尾添加(End Repair/dA-Tailing)

    该步骤将片段化的双链cDNA末端补平,并进行5’端磷酸化和3’端加dA尾。

    1. 将表8中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于无菌PCR管中配制表8所示反应体系。

    8  末端修复/dA尾添加反应体系

    名称

    体积(μL)

    Fragmented dscDNA

    50

    Endprep Buffer

    6

    Endprep Enzyme

    4

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

    4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表9所示反应程序,进行末端修复/dA尾添加反应。

    9  末端修复/dA尾添加反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    On

    30°C

    20 min

    72°C

    20 min

    4°C

    Hold

    3.4 接头连接(Adapter Ligation)

    该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端,连接特定的Illumina®接头。

    1. 参考注意事项三中的表1,根据Input RNA量,稀释Adapter至合适浓度。

    2. 将表10中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表10所示反应体系。

    10  Adapter Ligation体系

    名称

    体积(μL)

    dA-tailed DNA

    60

    Ligation Enhancer

    30*

    Quick T4 DNA Ligase

    5

    DNA Adapter

    5**

    【注】:*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

    **请根据注意事项三中表1的提示,用0.1×TE buffer对接头进行稀释,接头体积固定为5 μL

    4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表11所示反应程序,进行接头连接反应:

    11  Adapter Ligation反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    Off

    20°C

    15 min

    4°C

    Hold

    【注】:当Input DNA量较低时,可尝试将连接时间延长一倍,这将提高连接效率。

    3.5 连接产物纯化和片段大小分选(Post Ligation Clean Up and Size Selection)

    目前有两个方案应用于该步骤,当插入片段<200 bp时,使用方案A;当插入片段≥200 bp时,使用方案B。

    方案A:适用于插入片段150-200 bp的文库(mRNA打断方案为94°C15 min)

    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

    2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

    3. 吸取80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

    4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

    6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

    7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

    8. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行PCR扩增。

    方案B:适用于插入片段大于200 bp的文库(mRNA打断方案为94°C5~10 min)

    方案B-1:接头连接产物的纯化

    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

    2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

    3. 吸取80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

    4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

    6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

    7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

    8. 将PCR管从磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,准备进行双轮分选。

    【注】:ligation enhancer中含有的高浓度PEG 6000会对磁珠双轮分选产生影响,所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。

    方案B-2:双轮分选

    1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

    2. 根据DNA片段长度要求,参考表12,在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠,涡旋或移液器吹打10次混匀。

    12  磁珠文库分选推荐比例

    DNA文库插入片段大小(峰值,bp)

    ~ 200

    ~ 300

    ~ 400

    ~500

    94℃打断时间(min)

    10 ~ 15 min

    ~ 10 min

    ~ 8 min

    ~ 6 min

    短接头连接之后分选

    第一轮体积比

    0.82×

    0.72×

    0.62×

    0.58×

    第二轮体积比

    0.2×

    0.15×

    0.15×

    0.1×

      长接头连接之后分选或文库扩增之后分选

    第一轮体积比

    0.78×

    0.68×

    0.58×

    0.55×

    第二轮体积比

    0.15×

    0.15×

    0.15×

    0.15×

    【注】:此处文库大小指的是插入片段+短接头长度(60 bp)或插入片段+完整接头长度(120 bp),此表推荐的双轮分选比例适用于AMPure® XP磁珠和Hieff NGS® DNA Selection Beads;表中“×”表示样品DNA体积。如短接头文库大小为360 bp,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.72×100 μL=72 μL;第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL;

    3. 室温孵育5 min。

    4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中,残留1-2 μL溶液于管底。

    5. 参考表12向上清中加入第二轮分选磁珠。

    6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。

    7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    8. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

    9. 重复步骤8。

    10. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

    11. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

    12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净管中。

    3.6文库扩增(Library Amplification)

    该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

    1. 将表13中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用

    2. 于无菌PCR管中配制表13所示反应体系。

    13  PCR扩增反应体系

    短接头连接产物PCR反应体系

    长接头连接产物PCR反应体系

    组分名称

    体积(μL)

    组分名称

    体积(μL)

    2×Super Canace® II High-Fidelity Mix

    25

    2×Super Canace® II High-Fidelity Mix

    25

    Universal Primer/ i5 Primer*

    2.5

    Primer mix**

    5

    Index Primer/ i7 Primer*

    2.5

    Adapter Ligated DNA

    20

    Adapter Ligated DNA

    20

    ——

    ——

     

    【注】:*如果使用的是无barcode的接头,俗称短接头(小Y接头),请使用短接头试剂中配备的index primer进行扩增Cat#12611,Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 1; Cat#12612, Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 2。Cat#12613, Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 1; Cat#12614,Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 2。

    **如果您使用的是barcoded adapter,俗称长接头(大Y接头),即adapter上带有barcode,可使用本试剂盒中的Primer mix来进行扩增;

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表14示反应程序,进行PCR扩增

    14  PCR扩增反应程序

    温度

    时间

    循环数

    98°C

    1 min

    1

    98°C

    10 sec

    参照表2(注意事项五)

    60°C

    30 sec

    72°C

    30 sec

    72°C

    5 min

    1

    4°C

    Hold

    -

    3.7 扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection)

    3.5步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。

    3.8 文库质量控制

    通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。

    附录一:mRNA片段化

    image.png 

    2. mRNA不同打断时间对应的双链cDNA插入片段长度。取500 ng Universal Human Reference RNA,经过mRNA提取试剂盒提取后,分别以94°C处理5、10、15 min。打断后的mRNA进行双连cDNA的合成,经过1.8×磁珠回收后,所得结果通过Agilent 2100 Bioanalyer进行检测。

    【注】:本结果使用的RNA是Universal Human Reference RNA,若使用其他来源的RNA,需要优化打断时间;若构建插入片段>300 bp的文库,打断时间请选择5 min (此结果只展示片段化效果,并不代表产量的高低)。

    附录二:应用实例

    使用本试剂盒对500 ng Universal Human Reference RNA建库,mRNA打断时间为94°C,5 min,接头连接后进行双轮分选,产物经扩增、纯化后使用Agilent 2100 Bioanalyer进行检测。

     

    image.png 

    3. Universal Human Reference mRNA文库构建结果,从左往右依次使用0.8×/0.1、0.7×/0.1×、0.55×/0.1×双轮分选。


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