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Hieff NGS® MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina® MaxUp mRNA 建库试剂盒
产品货号:12301ES08
产品规格:8 T
产品价格:¥3826.00
类别:RNA-Seq

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff NGS® MaxUp   Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina®

    MaxUp mRNA 建库试剂盒

    12301ES08

    8 T

    3826.00

    12301ES24

    24 T

    9756.00

    12301ES96

    96 T

    32856.00

    产品描述

    Hieff NGS® MaxUp Dual-model mRNA Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒,本试剂盒cDNA二链合成模块配有两种buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-1μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、链双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增,总RNA样品最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。

    试剂盒包含三个独立模块,BOX-I的核心为纯化mRNA所需的poly(A)磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性dscDNA合成所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP,使cDNA第二链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异性。BOX-III实际上是一个高效的微量DNA文库构建试剂盒,来自我公司的Hieff NGS® MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina®。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

    产品组分

    组分编号和名称

    12301ES08

    12301ES24

    12301ES96

    BOX-I

    12603-A


    mRNA Capture Beads

    0.4 mL

    1.2 mL

    4.8 mL

    12603-B


    Bead Binding Buffer

    0.4 mL

    1.2 mL

    4.8 mL

    12603-C


    Beads Wash Buffer

    5 mL

    15 mL

    60 mL

    12603-D


    Tris Buffer

    0.4 mL

    1.2 mL

    4.8 mL

    BOX-II

    12250-A


    Frag/Prime Buffer

    150 μL

    450 μL

    900 μL×2

    12250-B


    1st Strand Synthesis Enzyme   Mix

    16 μL

    48 μL

    192 μL

    12250-C


    Strand Specificity Reagent

    50 μL

    150 μL

    580 μL

    12250-D


    2nd Strand Synthesis Buffer   (with dNTP)

    162 μL

    485 μL

    965 μL×2

    12250-E


    2nd Strand Synthesis Buffer   (with dUTP)

    162 μL

    485 μL

    965 μL×2

    12250-F


    2nd Strand Synthesis Enzyme   Mix

    41 μL

    121 μL

    482 μL

    BOX-III

    12200-A


    Endprep   Buffer

    48 μL

    144 μL

    576 μL

    12200-B


    Endprep   Enzyme

    32 μL

    96 μL

    384 μL

    12200-C


    Ligation Enhancer

    240 μL

    720 μL

    4×720 μL

    12200-D


    Quick T4 DNA Ligase

    40 μL

    120 μL

    480 μL

    12200-E


    2× Super Canace® II High-Fidelity Mix

    200 μL

    600 μL

    4×600 μL

    12200-F


    Primer Mix

    40 μL

    120 μL

    480 μL

    运输与保存方法

    冰袋运输。效期一年。存储温度如下,切不可搞错!

    Box I:2-8保存;Box II:-20保存;Box III:-20保存

    注意事项
    一、 关于操作

    1.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
    2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

    3.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

    4.请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
    5.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。

    二、应用范围

    本试剂盒适用于起始模板量为10-1000 ng(体积≤50 μL)的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低,体积超过50 μL,可使用Hieff NGS® RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测,RIN值要求>7,以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。

    本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo d(T)磁珠,只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的mRNA,如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外,FFPE样本中的mRNA降解严重,通常无完整的poly(A)尾结构,故亦无法使用本试剂盒进行建库。

    本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用,包括:

    基因表达(gene expression)

    单核苷酸变异检测(single nucleotide variation discovery)

    基因融合鉴定(gene fusion identification)

    剪切变异体分析(splice variant analysis)

    三、关于接头连接(Adapter Ligation)

    1.本试剂盒推荐使用短接头(也称为小Y接头、不完整接头)进行建库,目前我公司可提供单端 96种 Index Kit 和双端 384 种 Index Kit。

    单端 96 种 Index Kit:Cat#12611,Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina® , Set 1(48 种); Cat#12612,Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 2(48 种)。

    双端 384 种 Index Kit:Cat#12613,Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 1(96 种); Cat#12614,Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 2(96 种)。

    2.我们建议选用高质量的商业化接头,如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。

    3.使用接头时,请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻;在室温操作时,实验室温度最好不要超过25°C,防止接头解链。

    4.建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。

    表1 Input Total RNA量与接头浓度推荐表

    Input   Total RNA

    Adapter stock   concentration

    10–100 ng

    0.15 μM

    100–499 ng

    1.5 μM

    500–1000 ng

    5 μM

    四、关于磁珠纯化与分选(Beads-based Clean Up and Size Selection)

    1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

    2.磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

    3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

    4.转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

    5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

    6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

    7.DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存1周,-20°C可保存1个月。

    五、关于文库扩增(Library Amplification)

    1.本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。

    2.如果您使用barcoded adapter(也成为长接头、大Y接头),可使用本试剂盒提供的引物Primer mix进行扩增;如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”,则需要使用index primers进行扩增,加上相应的barcodes。

    3.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。

    表2 Input Total RNA量与扩增循环数推荐表*

    Input   Total RNA

    Number of cycles

    10 ng

    15–16

    100 ng

    12-14

    1000 ng

    8–10

    【注】:*如使用链特异性文库构建方案,产量会相对减少,故选择高的循环数;否则,低循环数已经足够获得测序文库。当使用的总RNA质量较差时,可适当增加1-2循环。

    六、关于文库质检(Library Quality Analysis)

    1.通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

    2.文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。

    3.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

    4.文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

    5.文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

    使用方法

        一、自备材料

    1.纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)或AMPure XP Beads(Cat#A63880)或其他等效产品。

    2.RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

    3.Adapters:barcoded adapter(长接头)或者无barcode的短接头试剂盒。

    4.文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

    5.其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

    二、操作流程

    10.png

      图1 mRNA建库试剂盒操作流程

          三、操作步骤

    3.1 mRNA纯化和片段化(mRNA Purification and Fragmentation)

    1.将mRNA Capture Beads从2-8℃取出,静置使其温度平衡至室温,约30 min。

    2.准备一个Nuclease free离心管,将0.01-1 μg总RNA溶解至50 μL Nuclease free水中,冰上放置备用。

    3.颠倒或旋涡振荡混匀磁珠,吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中,用移液器吹打6次,使其充分混匀。

    4.将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中,65℃,5 min;4℃,hold,使得RNA变性。

    5.室温孵育5 min,使mRNA与磁珠完全结合。

    6.将样品置于磁力架中,室温静置5 min,使mRNA与总RNA分离,小心移除上清。

    7.将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中,

    室温静置5 min,小心移除上清。

    8.重复步骤7,共洗涤两次。

    9.将样品从磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

    10.将样品置于PCR仪中,80℃,2 min;25℃,hold,将mRNA洗脱下来。

    11.加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

    12.室温放置5 min,使mRNA结合到磁珠上。

    13.将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。
    14.将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀,将样品重新放回至磁力架中,室温静置5 min,吸掉全部上清。

    【注】:最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。

    15.将样品从磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠,用移液器吹打6次以彻底混匀;将样品置于PCR仪中(预设为94℃或85℃),可参考表3选择片段化程序,但不同物种片段化的效果有差异,客户可先根据自己的情况,做个片段化时间的梯度,比如94℃,5 min或85℃,6 min。使用Agilent 2100分析双链cDNA纯化产物大小。

    表3 mRNA片段化程序选择

    插入片段大小(bp)

    打断程序

    Hold

    150-200

    94°C,6 min;

    4°C

    200-300

    94°C,5 min;

    4°C

    250-450

    85°C,8 min;

    4°C

    400-550

    85°C,6 min;

    4°C

    16. 片段化程序结束后,立即将样品置于磁力架中,转移17 μL上清至一个新的nuclease free离心管中,立刻进入第一链合成反应。

    3.2 双链cDNA的合成与纯化(cDNA Synthesis and Purification)

    第一链cDNA的合成:

    1. 将1st Strand Synthesis Reaction Buffer从-20°C取出,解冻后颠倒混匀。按表4所示,配制第一链cDNA合成的反应液。

    表4 第一链cDNA合成反应体系

    名称

    体积(μL)

    Fragmented mRNA

    17

    Strand Specificity Reagent

    6

    1st Strand Synthesis Enzyme   Mix

    2

    2. 使用移液器轻轻吹打或涡旋震荡混匀,瞬离将反应液离心至管底。

    3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表5所示设置反应程序,进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

    表5  第一链cDNA合成反应程序

    温度

    时间

    热盖 105°C

    On

    25°C

    10 min

    42°C

    15 min

    70°C

    15 min

    4°C

    Hold

    第二链cDNA的合成:

    1. 将2nd Strand Synthesis Buffer从-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表6所示,配制第二链cDNA合成反应液。

    表6  第二链cDNA合成反应体系

    名称

    体积(μL)

    1st Strand cDNA

    25 μL

    2nd Strand Synthesis Buffer   (with dNTP or dUTP)*

    20 μL

    2nd Strand Synthesis Enzyme   Mix

    5 μL

    【注】:*如构建普通mRNA文库,请使用含dNTP的buffer;如构建链特异性mRNA文库,请使用含dUTP的buffer。

    2. 使用移液器轻轻吹打或涡旋震荡混匀,瞬离将反应液离心至管底。

    3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表7所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。

    表7  第二链cDNA合成反应程序

    温度

    时间

    热盖 105°C

    Off

    16°C

    1 h

    4°C

    Hold

    双链cDNA纯化:

    该步骤将对获得的双链cDNA进行纯化。

    1. 将Hieff NGS® DNA Selection Beads DNA (Cat#12601)提前30 min从2-8℃取出,室温静置使其温度平衡至室温。

    2. 颠倒或旋涡振荡使Hieff NGS® DNA Selection Beads充分混匀,吸取90 μL (1.8 ×)磁珠悬液加入到第二链cDNA样品(50 μL)中,涡旋振荡或使用移液器吹打使其充分混匀。

    3. 室温孵育5 min。

    4. 磁力架上静置5 min。待溶液澄清后,保持样品始终处于磁力架中,小心移除上清。

    5. 保持样品始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠(注意不要吹散磁珠),室温孵育30 sec,小心移除上清。

    6. 重复上一步,总计漂洗2次。

    7. 保持样品始终处于磁力架中,开盖空气干燥磁珠5 min。

    8. 将样品从磁力架中取出,加入51 μL nuclease free水,涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀,室温静置5 min。瞬离后在磁力架上静置5 min,待溶液澄清后,小心吸取50 μL上清至一个新的nuclease free离心管中。

    3.3 末端修复/dA尾添加(End Repair/dA-Tailing)

    该步骤将片段化的双链cDNA末端补平,并进行5’端磷酸化和3’端加dA尾。

    1. 将表8中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于无菌PCR管中配制表8所示反应体系。

    表8  末端修复/dA尾添加反应体系

    名称

    体积(μL)

    Fragmented dscDNA

    50

    Endprep Buffer

    6

    Endprep Enzyme

    4

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

    4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表9所示反应程序,进行末端修复/dA尾添加反应。

    表9  末端修复/dA尾添加反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    On

    30°C

    20 min

    72°C

    20 min

    4°C

    Hold

    3.4 接头连接(Adapter Ligation)

    该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端,连接特定的Illumina®接头。

    1. 参考注意事项三中的表1,根据Input RNA量,稀释Adapter至合适浓度。

    2. 将表10中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表10所示反应体系。

    表10  Adapter Ligation体系

    名称

    体积(μL)

    dA-tailed DNA

    60

    Ligation Enhancer

    30*

    Quick T4 DNA Ligase

    5

    DNA Adapter

    5**

    【注】:*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

    **请根据注意事项三中表1的提示,用0.1×TE buffer对接头进行稀释,接头体积固定为5 μL。

    4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表11所示反应程序,进行接头连接反应:

    表11  Adapter Ligation反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    Off

    20°C

    15 min

    4°C

    Hold

    【注】:当Input DNA量较低时,可尝试将连接时间延长一倍,这将提高连接效率。

    3.5 连接产物纯化和片段大小分选(Post Ligation Clean Up and Size Selection)

    目前有两个方案应用于该步骤,当插入片段<200 bp时,使用方案A;当插入片段≥200 bp时,使用方案B。

    方案A:适用于插入片段150-200 bp的文库(mRNA打断方案为94°C,6 min)

    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

    2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

    3. 吸取80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

    4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

    6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

    7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

    8. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行PCR扩增。

    方案B:适用于插入片段大于200 bp的文库(mRNA打断方案为94°C,5 min或85℃,8 min)

    方案B-1:接头连接产物的纯化

    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

    2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

    3. 吸取80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

    4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

    6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

    7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

    8. 将PCR管从磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,准备进行双轮分选。

    【注】:Ligation Enhancer中含有的高浓度PEG 6000会对磁珠双轮分选产生影响,所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。

    方案B-2:双轮分选

    1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

    2. 根据DNA片段长度要求,参考表12,在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠,涡旋或移液器吹打10次混匀。

     

    表12  磁珠文库分选推荐比例

    DNA文库插入片段大小(峰值,bp

    ~ 200

    ~ 300

    ~ 400

    ~500

    打断条件

    94℃,5   min

    85℃,8 min

    85℃,8   min

    85℃,6   min

    短接头连接之后分选

    第一轮体积比

    0.82×

    0.72×

    0.62×

    0.58×

    第二轮体积比

    0.2×

    0.15×

    0.15×

    0.1×

      长接头连接之后分选或文库扩增之后分选

    第一轮体积比

    0.78×

    0.68×

    0.58×

    0.55×

    第二轮体积比

    0.15×

    0.15×

    0.15×

    0.15×

    【注】:此处文库大小指的是插入片段+短接头长度(60 bp)或插入片段+完整接头长度(120 bp),此表推荐的双轮分选比例适用于AMPure® XP磁珠和Hieff NGS® DNA Selection Beads;表中“×”表示样品DNA体积。如短接头文库大小为360 bp,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.72×100 μL=72 μL;第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL;

    3. 室温孵育5 min。

    4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中,残留1-2 μL溶液于管底。

    5. 参考表12向上清中加入第二轮分选磁珠。

    6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。

    7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    8. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

    9. 重复步骤8。

    10. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

    11. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

    12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净管中。

    3.6文库扩增(Library Amplification)

    该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

    1. 将表13中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于无菌PCR管中配制表13所示反应体系。

    表13-A  短接头连接产物PCR反应体系表                                     表13-B  长接头连接产物PCR反应体系

    组分名称

    体积(μL

    2×Super   Canace® II High-Fidelity Mix

    25

    Universal Primer/ i5 Primer*

    2.5

    Index Primer/ i7 Primer*

    2.5

    Adapter Ligated DNA

    20

    组分名称

    体积(μL

    2×Super   Canace® II High-Fidelity Mix

    25

    Primer mix**

    5

    Adapter Ligated DNA

    20

    【注】:*如果使用的是无barcode的接头,俗称短接头(小Y接头),请使用短接头试剂中配备的index primer进行扩增(Cat#12611,Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 1; Cat#12612, Hieff NGS® 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 2。Cat#12613, Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 1; Cat#12614,Hieff NGS® 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 2。)

    **如果您使用的是barcoded adapter,俗称长接头(大Y接头),即adapter上带有barcode的完整接头,可用试剂盒中的Primer Mix进行扩增;

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表14示反应程序,进行PCR扩增。

    表14  PCR扩增反应程序

    温度

    时间

    循环数

    98°C

    1 min

    1

    98°C

    10 sec

    参照表2(注意事项五)

    60°C

    30 sec

    72°C

    30 sec

    72°C

    5 min

    1

    4°C

    Hold

    -

    3.7 扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection)

    同3.5步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。

    3.8 文库质量控制

    通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。

    附录一:mRNA片段化
    11.png

    图2. mRNA不同打断时间对应的双链cDNA片段范围。取1 μg Universal Human Reference RNA,经mRNA提取试剂盒提取后,分别以94°C,6 min、85℃,8 min和85℃,5 min处理。打断后mRNA进行双连cDNA的合成,经过1.8×磁珠回收后,通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

    【注】:本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA,若使用其他来源的RNA,最好优化打断时间。

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