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Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® 一步法DNA建库试剂盒
产品货号:12203ES08
产品规格:8 libraries
产品价格:¥3656.00
类别:DNA-Seq

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  • 产品信息


    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®

    一步法DNA建库试剂盒

    12203ES08

    8 T

    3656.00

    12203ES24

    24 T

    7486.00

    12203ES96

    96 T

    28567.00

     

    产品描述

    Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较,本品采用高质量的酶学组成,摆脱了繁琐的超声过程,具有优秀的文库转化率与扩增效率,可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单。

    适用500 pg-100 ng的基因组DNAcDNA等样本

     * 高质量片段化酶,优化的缓冲体系,具有高效稳定的片段化效果

    强扩增效率的高保真酶,显著提高文库转化率与扩增效率

    *  多样本验证可获得优异的文库与测序数据

    严格的批次性能与稳定率性质控


    产品组分

    组分编号与名称

    12203ES08

    12203ES24

    12203ES96

    12203-A

    5×Smearase® Reaction   Buffer

    32 μL

    96 μL

    384 μL

    12203-B

    dsDNA   Smearase® Enzyme

    8 μL

    24 μL

    96 μL

    12203-C


    Endprep   Buffer

    48 μL

    144 μL

    576 μL

    12203-D


    Endprep   Enzyme

    32 μL

    96 μL

    384 μL

    12203-E

    Ligation Enhancer

    240 μL

    720 μL

    4×720 μL

    12203-F

    Quick T4 DNA Ligase

    40 μL

    120 μL

    480 μL

    12203-G

    2× Super Canace® Ⅱ High-Fidelity Mix

    200 μL

    600 μL

    4×600 μL

    12203-H

    Primer mix

    40 μL

    120 μL

    480 μL


    运输与保存方法

    冰袋运输。所有组分-20°C保存,有效期1年。


    注意事项

    一、关于操作

    1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

    3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

    4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

    5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

    6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用专用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。


    二、关于
    DNA片段化

    1. 本试剂盒为酶切法片段化DNA

    2. 本试剂盒兼容范围为500 pg – 100 ng Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA

    3. Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将DNA稀释在TE Buffer中进行片段化。请勿使用EDTA终止反应,65℃加热即可使片段化酶失活。

    4. 参照片段化步骤可将DNA酶切为150-550 bp左右,为保证优质稳定的片段化效果,片段化过程请于冰上操作。


    三、关于接头连接(
    Adapter Ligation

    1. 针对Illumina®测序平台,Yeasen提供48Indexed AdaptersCat#12615Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 112种);Cat#12616Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 212种);Cat#12617Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 312种);Cat#12618Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 412种)。

    2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer;用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒,不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

    1  500 pg-100 ng Input DNA推荐的Adapter使用浓度

    Input DNA

    Adapter : Input DNA摩尔比

    Input DNA

    Adapter : Input DNA摩尔比

    100 ng

    100:1

    10 ng

    200:1

    50 ng

    100:1

    1 ng

    200:1

    25 ng

    200:1

    500 pg

    400:1


    【注】:
    Input DNA摩尔数(pmol≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp]


    四、关于磁珠纯化与分选(
    Bead-based Clean Up and Size Selection

    1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前,或接头连接后,或文库扩增后进行。

    2. Input DNA质量≥50 ng,您可选择在接头连接后分选;如Input DNA质量<50 ng,建议您在文库扩增后进行分选。

    3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG,会对双轮分选产生显著影响。因此,如在接头连接后进行长度分选,必须先进行纯化步骤,再进行双轮分选步骤;如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选,可直接进行双轮磁珠分选步骤。

    4. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

    5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

    6. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

    7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

    8. 进行长度分选时,初始样品体积应尽量≥100 μL,不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。

    9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

    10. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于4°C可保存1-2周,-20°C可保存1个月。


    五、关于文库扩增(
    Library Amplification

    文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒,获得600 ng文库的推荐循环数。

    2  500 pg-100 ng Input DNA获得600 ng产物扩增循环数推荐表

    Input   DNAng

    Number of cycles required to   generate

    600 ng

    100 ng

    6 - 8**

    50 ng

    7 - 9

    8 ng

    10 - 12

    2 ng

    12 - 14

    1 ng

    13 - 15

    500 pg

    14 - 16


    【注】:
    **如果使用了不完整的接头,需要扩增1-3个循环,形成完整的接头。建库过程中进行过长度分选时参照较高循环数扩增。


    六、关于文库质检(
    Library Quality Analysis

    1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

    2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。

    3. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

    4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

    5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。


    使用方法

    一、自备材料

    1. 纯化磁珠:Cat#12601Hieff NGS® DNA Selection BeadsCat#A63880AMPure XP Beads或其他等效产品。

    2. DNA质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

    3. DNA Adapter:可选Yeasen Cat#12615Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1Cat#12616Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2Cat#12617Hieff NGS®Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3Cat#12618Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4;或其他等效产品。

    4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer10 mM Tris-HClpH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。


    二、操作流程

     

    image.png

    1 OnePot DNA建库试剂盒操作流程

    三、操作步骤

    3.1 DNA片段化(DNA Fragment

    该步骤将基因组DNA片段化,片段化之后加热使酶失活。

    1. 将表3中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 冰上配制表3反应体系。

    3  DNA片段化PCR反应体系

    名称

    体积(μL

    Input   DNA

    x

    5×Smearase® Reaction Buffer

    4

    dsDNA Smearase® Enzyme

    1

    ddH2O

    Up to 20   μL

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

    4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表4所示反应程序,进行DNA片段化反应。

    4  DNA片段化PCR反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    On

    42°C

    15 min

    65°C

    10 min

    4°C

    Hold


    3.2 
    末端修复/dA尾添加(End Preparation/dA-Taling

    该步骤将片段化DNA进行末端修复和dA尾添加。

    1. 将表5中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。

    5  末端修复/dA尾添加PCR反应体系

    名称

    体积(μL

    Fragmented   DNA

    x

    Endprep   Buffer

    6

    Endprep   Enzyme

    4

    ddH2O

    Up to   60 μL

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

    4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表6所示反应程序,进行末端修复/dA尾添加反应。

    6  末端修复/dA尾添加PCR反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    On

    30°C

    20 min

    72°C

    20 min

    4°C

    Hold


    3.3 
    接头连接(Adapter Ligation

    该步骤将3.2步骤的产物末端,连接特定的Illumina®接头。

    1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。

    2. 将表7中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    3. 3.2步骤PCR管中配制表7所示反应体系。

    7  Adapter Ligation PCR体系

    名称

    体积(μL

    dA-tailed DNA3.2步骤产物)

    60

    Ligation Enhancer

    30*

    Quick T4 DNA Ligase

    5

    DNA Adapter

    5**


    【注】:
    *Ligation Enhancer比较粘稠,请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

    **本公司接头浓度(Cat#12615Cat#12616Cat#12617Cat#12618)与常规商业化试剂盒一致,皆为15 μmol/L

    【接头添加计算举例】Input DNA100 ngInput DNA长度为300 bp时,接头应该添加多少?

    第一步:计算Input DNA摩尔数。公式:Input DNA摩尔数(pmol≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp]

    Input DNA摩尔数(pmol=100÷0.66×300=0.5 pmol

    第二步:计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表1查询接头添加比例;

    根据表1,查得Input DNA 100 ng时接头添加比例100:1,则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol

    第三步:计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L(如使用其他接头,浓度需要依据其他接头浓度参数);

    接头添加体积=接头添加摩尔数(50 pmol÷接头浓度(15 μmol/L=3.34 μL(注:15 μmol/L=15 pmol/μL

    综上,接头可添加3.4 μL,加1.6 μL水补齐至5 μL。(注:接头最大加入体积不超过5 μL)。

    4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    5. PCR管置于PCR仪中,设置表8所示反应程序,进行接头连接反应。

    8  Adapter Ligation PCR反应程序

    温度

    时间

    热盖105°C

    Off

    20°C

    15 min

    4°C

    Hold

    【注】:Input DNA量较低,实验效果不理想时,可尝试将连接时间延长一倍。


    3.4 
    连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up

    该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的AdapterAdapter Dimer等无效产物。


    3.4.1 
    纯化操作步骤:

    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

    2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

    3. 吸取80 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads0.8×Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min

    4. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

    6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

    7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

    8. PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:

    1)如产物无需进行片段分选,直接加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。

    2)如产物需进行双轮分选,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。


    3.4.2 
    双轮分选操作步骤:

    1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡约30 min。配制80%乙醇。

    2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

    3. 根据DNA片段长度要求,参考表9向上述100 μL DNA上清中加入第一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。

     9  磁珠文库分选推荐比例

    DNA文库插入片段大小

    150-250 bp

    200-300 bp

    300-400 bp

    400-500 bp

    500-600 bp

    DNA文库大小

    250-350 bp

    350-450 bp

    450-550 bp

    550-650 bp

    650-750 bp

    第一轮体积比(Beads:DNA

    0.80×

    0.70×

    0.60×

    0.55×

    0.50×

    第二轮体积比(Beads:DNA

    0.20×

    0.20×

    0.20×

    0.15×

    0.15×

    【注】:表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为250 bp,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.70×100 μL=70 μL;第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL;表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNAPost Ligation),如果用户在接头连接前进行分选,请采用Hieff NGS® DNA Selection BeadsCat#12601)说明书中推荐的比例。

    4. 室温孵育5 min

    5. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。

    6. 参考表9向上清中加入第二轮分选磁珠。

    7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min

    8. PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

    9. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

    10. 重复步骤9

    11. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

    12. PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min

    13. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中。


    3.5 
    文库扩增(Library Amplification

    该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

    1. 将表10中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

    2. 于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。

    10  PCR扩增反应体系

    名称

    体积(μL

    2×Super Canace® Ⅱ High-Fidelity Mix

    25

    Primer   mix

    5

    Adapter   Ligated DNA3.3步骤产物)

    20

    3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

    4. PCR管置于PCR仪中,设置表11所示反应程序,进行PCR扩增。

    11  PCR扩增反应程序

    温度

    时间

    循环数

    98°C

    1 min

    1

    98°C

    10 sec

    参照注意事项中表2

    60°C

    30 sec

    72°C

    30 sec

    72°C

    5 min

    1

    4°C

    Hold

    -


    3.6 
    扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection

    3.4.1步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads0.9×Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。

    如需分选,操作方法同3.4.2双轮分选步骤(纯化步骤可省略)。


    3.7 
    文库质量控制

    通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。


    3.8 
    参考实例

    使用Hieff NGS® OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®50 ng Human gDNA样本建库(0.7× 0.2×双轮分选),结果使用Agilent 2100 DNA 1000 Chip进行检测。

    12203.jpg 

    2  OnePot DNA建库试剂盒用于Human gDNA样本


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    规格

    价格(元)

    Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1

    12615ES04/16

    12×4/12×16 T

    1256/4536

    Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2

    12616ES04/16

    12×4/12×16 T

    1256/4536

    Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3

    12617ES04/16

    12×4/12×16 T

    1256/4536

    Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4

    12618ES04/16

    12×4/12×16 T

    1256/4536

    Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®,(96 Index)

    12610ES96

    96 T

    1365

    建库模块

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module

    12607ES08/24/96

    8/24/96 T

    1423/3263/10863

    Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module

    12608ES24/96

    24/96 T

    2066/6166

    2×Super Canace® High-Fidelity Mix for Library Amplification

    12621ES24/96

    24/96 T

    583/1783

    Hieff NGS® Dual-Mode cDNA Synthesis Kit

    12250ES24/96

    24/96 T

    4885/16485

    文库定量

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, qPCR Master Mix

    12302ES05

    500 T

    1526

    Hieff NGS® Library Quantification Kit for Illumina®, DNA Standard (1-6)

    12307ES09

    6×96 μL

    2126

    dsDNA HS Assay Kit for Qubit® 

    12640ES60/76

    100/500 T

    686/2696

    多重PCR

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff® Multiplex PCR Kit

    12279ES50/76

    100/500 T

    875/3165

    Hieff® Multiplex PCR Master Mix

    12280ES50/76

    50 /200 T

    875/3165

     

     

    HB190103