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400-6111-883
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400-6111-883
Annexin V-EGFP/PI 细胞凋亡检测试剂盒
产品货号:40303ES20
产品规格:20T
产品价格:¥480.00
类别:细胞凋亡与吞噬

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Detection Kit

    Annexin V-EGFP/PI 细胞凋亡检测试剂盒

    40303ES20

    20 T

    480.00

    40303ES50

    50 T

    960.00

    40303ES60

    100 T

    1680.00 


    产品描述

    Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒是用EGFP标记了的Annexin V作为探针,来检测细胞早期凋亡的发生

    其检测原理为:在正常的活细胞中,磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserinePS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KDCa2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

    另外,本试剂盒中还提供了碘化丙啶(Propidium IodidePI)用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但可以透过凋亡晚期和坏死细胞细胞膜而使细胞核染红。因此,将Annexin VPI联合使用时,PI 则被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被EGFP PI 结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。

    本试剂盒需要使用流式细胞仪进行检测



    产品组分

    编号

    组分

    产品编号/规格

    40303ES20(20T)

    40303ES5050T

    40303ES60100T

    40303-A

    Annexin V-EGFP

    0.1 mL

    0.25 mL

    0.5 mL

    40303-B

    PI Staining Solution

    0.2 mL

    0.5 mL

    1 mL

    40303-C

    4×Binding Buffer

    4 mL

    10 mL

    20 mL


    运输与保存方法


    冰袋运输。本试剂盒中所有组分均在4℃保存,勿冰冻。Annexin V-EGFP、PI需避光保存。一年有效。


    注意事项

    1)由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。

    2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-EGFP的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后,轻摇时胰酶与细胞充分接触,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

    3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定前需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用Binding Buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。

    4)如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。

    5)试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。

    6)Annexin V-EGFP和PI是光敏物质,在操作时请注意避光。

    操作方法

    实验设计

    空白管:阴性对照细胞,不加Annexin V-EGFP和 PI Staining Solution ,用于调节电压。

    单染管:阳性对照细胞,只加Annexin V-EGFP,用于调节补偿。

    检测管:处理的细胞,加Annexin V-EGFP和PI Staining Solution。利用空白管和单染管调节好的参数进行实验数据的获得。

    1.1 样品染色

    1)悬浮细胞:300 g,4℃离心5 min收集细胞

       贴壁细胞:用不含EDTA的胰酶消化后,300 g,4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长,以防引起假阳性;

    2)用预冷的PBS洗涤细胞2次,每次均需300 g,4℃离心5 min;

    3)用去离子水按照1:3的比例稀释4×Binding Buffer(例如:4mL 4×Binding Buffer+12mL去离子水);

    4)用1×Binding Buffer重新悬浮细胞,调节其浓度为1~5×106/mL;

    5)取100 μL的细胞悬液于5 mL的流式管中,加入5 μL Annexin V-EGFP,混匀后于室温避光孵育5 min;

    6)加入10 μL PI Staining Solution,并加400 μLPBS,立刻进行流式检测。

    【注】:用流式检测凋亡时,PI受时间的影响很大,时间过长会导致PI的染色增加,所以需要在1个小时内完成流式检测。

    1.2流式细胞仪分析

    EGFP最大激发波长为488 nm,最大发射波长为507 nm;PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm,最大发射波长为615 nm。用CellQuest等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),EGFP为横坐标,PI为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型的实验中,细胞可以分成三个亚群,活细胞仅有很低强度的背景荧光,早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光,晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。


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                   HB181205