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Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法,No Rox)
产品货号:11198ES03
产品规格:1 ml
产品价格:¥196.00
类别:染料法

说明书下载

  • 产品名称

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    促销价(元)

    Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix

     (抗体法,No Rox)

    11198ES03

    1 ml

    336.00

    196.00

    11198ES08

    5×1 ml

    1466.00

    586.00

    11198ES25

    5 ml

    6156.00

    /

    11198ES50

    10×5 ml

    11086.00

    /

    11198ES60

    20×5 ml

    17596.00

    /


    产品描述

    本产品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动DNA聚合酶货号10113),在预变性温度(95℃)加热30 sec,UNICON® Taq抗体失活,释放出Taq DNA Polymerase活性。抗体法热启动Taq酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时,配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子,适合低浓度模板的扩增,使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。

    Mix中含有Hieff® Taq DNA PolymeraseUNICON® Taq抗体、SYBR Green IdNTPs、Mg2+。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR,大大简化操作过程,降低污染几率。


    运输与保存
    方式

    冰袋运输。-20℃避光储存,有效期18个月。

    本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I,保存或配制反应体系时需避免强光照射。


    注意事项

    1. 解冻后Master Mix可能出现絮状物质,4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清,不影响试剂性能。

    2. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒(货号:11123ES),以有效去除RNA样品中残留的基因组。

    3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。


    反应体系
    (推荐冰上配制)

    组分

    体积(μl)

    体积(μl)

    终浓度

    Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法,No Rox)

    25

    10

    Forward Primer (10 μM)

    1

    0.4

    0.2 μM

    Reverse Primer (10 μM)

    1

    0.4

    0.2 μM

    模板DNA

    X

    X

    -

    无菌超纯水

    to 50

    to 20

    -


    】:使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。

    a) 引物浓度通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

    b) 模板浓度:如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10

    c) 模板稀释:cDNA原液建议5-10倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

    d) 反应体系推荐使用20 μl50 μl,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

    e) 体系配制:请于超净工作台内配制,并使用无核酸酶残留的枪头、反应管;推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。


    扩增程序(两步法)                                                                       扩增程序(三步法)

    循环步骤

    温度

    时间

    循环数


    循环步骤

    温度

    时间

    循环数

    预变性

    95℃

    30sec

    1


    预变性

    95℃

    30sec

    1

    变性

    95℃

    10sec

    40


    变性

    95℃

    10sec

    40

    退火/延伸

    60℃

    30sec


    退火

    55-60℃

    20sec






    延伸

    72℃

    20sec

    熔解曲线阶段

    仪器默认设置

    1


    熔解曲线阶段

    仪器默认设置

    1


    【注】:

    高特异性可选择两步法,高效率扩增可选择三步法。

    a) 预变性时间:本反应条件适合大多数基因扩增,如果遇到含有复杂结构的基因可适当增加预变性时间至3-5 min。

    b) 退火温度和时间:请根据引物和目的基因的长度进行调整。

    c) 荧光信号采集(★):请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置,几种常见仪器的时间设定如下:

    30sec以上:Applied Biosystems: StepOne , StepOne Plus, 7500 Fast;Roche Applied Science: LightCycler 480;Bio-Rad: CFX96

    31sec以上:Applied Biosystems: 7300

    34sec以上:Applied Biosystems: 7500

    d) 熔解曲线:通常情况下可以使用仪器默认程序。


    结果分析

    定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

    1) 扩增曲线标准扩增曲线为S型。

    Ct值落在20-30之间时,定量分析最准确;

    Ct值小于10,需要将稀释模板后,重新进行实验;

    Ct值介于30-35之间时,需要提高模板浓度,或者增大反应体系的体积,以提高扩增效率,保证结果分析的准确性;

    Ct值大于35时,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。

    2) 熔解曲线

    熔解曲线单峰,表明反应特异性好可以进行定量结果分析;若熔解曲线出现双峰或者多峰,则不能进行定量分析。

    熔解曲线出现双峰,需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

    如果是引物二聚体,建议降低引物浓度,或者重新设计扩增效率高的引物。

    如果是非特异性扩增,请提高退火温度,或者重新设计更高特异性的引物。

    引物设计指南

    1)推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳,不要低于100 bp,可以在100 bp-300 bp内选择。

    2)正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

    3 引物碱基分布要均匀,避免出现连续的4个相同碱基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C

    4)引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列

    5)引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

    6)设计完成的引物需要进行扩增效率的检测,只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析

    适用机型

    Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

    Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

    Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

    Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

    Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.


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