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400-6111-883
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400-6111-883
Hieff UNICON® qPCR TaqMan Probe Master Mix
产品货号:11205ES03
产品规格:1 ml
产品价格:¥225.00
类别:探针法

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Hieff UNICON® qPCR TaqMan Probe Master Mix

    11205ES03

    1 mL

    225.00

    Hieff UNICON® qPCR TaqMan Probe Master Mix

    11205ES08

    5 mL

    740.00 


    产品描述

    本产品是探针法2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动UNICON® DNA聚合酶(货号:10113ES)可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时,配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子,适合低浓度模板的扩增,使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。


    产品组分

    组分编号

    组分名称

    产品编号/规格

    11205ES03(1 mL

    11205ES08(5 mL

    11205-A

    2×Hieff UNICON® qPCR TaqMan Probe Master Mix

    1 mL

    1 mL × 5

    11205-B

    50×Low Rox

    40 μL

    200 μL

    11205-C

    50×High Rox

    40 μL

    200 μL


    输与保存方式

    冰袋运输。-20℃避光储存,有效期18个月。本品避免反复冻融。
    建议分装保存。


    反应体系

    组分

    体积(μl)

    体积(μl)

    终浓度

    2×Hieff® qPCR TaqMan Probe Master Mix

    10

    25

    Forward Primer (10 μM)

    0.4

    1

    0.2 μM

    Reverse Primer (10 μM)

    0.4

    1

    0.2 μM

    TaqMan Probe (10 μM)

    0.2

    0.5

    0.1 μM

    50×High or Low Rox

    0.4

    1

    模板DNA

    X

    X

    -

    无菌超纯水

    to 20

    to 50

    -


    : 使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。
    a) 参比染料:Rox的添加,可根据不同仪器型号进行选择,具体可参考【适用机型】。
    b) 引物浓度:通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。
    c) 探针浓度:探针终浓度在50 nM-250 nM之间。
    d) 模板浓度:如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。
    e) 模板稀释:cDNA原液建议5-10倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。
    f) 反应体系:推荐使用20 μl或50 μl,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。
    g) 体系配制:请于超净工作台内配制,并使用无核酸酶残留的枪头、反应管;推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。


    扩增程序 (两步法程序)

    循环步骤

    温度

    时间

    循环数

    预变性

    95℃

    1 min

    1

    变性

    95℃

    10 sec

    40

    退火、延伸

    60℃

    30 sec


    注:

    a) 预变性时间:根据不同模板和引物的具体情况可适当增加预变性时间至3 - 5 min。
    b) 退火温度和时间:建议在56-64℃范围内调整。如果反应效果不好,可以适当延长反应时间。
    c) 荧光信号采集:请参考仪器设置。


    结果分析

    定量实验至少需要三个生物学重复。
    反应结束后需要确认扩增曲线。进行PCR定量时,需要制作标准曲线。
    反应特异性需要琼脂糖凝胶电泳确认。


    引物设计指南

    1)推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳,不要低于100 bp,可以在100 bp-300 bp内选择。
    2)正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。
    3)引物碱基分布要均匀,避免出现连续的4个相同碱基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
    4)引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
    5)引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。


    TaqMan 探针设计指南

    1)探针长度一般为18-40 bp。探针序列应尽量接近正向或者反向引物,但不能与之有重合区域。
    2)探针的退火温度应为 65-67℃。
    3)引物碱基分布要均匀,避免出现连续的4个相同碱基。探针5’端应避免使用碱基G。
    4)若序列中包含多态性位点,应使其位于探针序列中间。


    适用机型

    High Rox适用机型ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™;
    Low Rox 适用机型ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™6,7,12k Flex;
    Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™;  
    不需要Rox校正的仪器型号
    Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™;
    Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s;
    Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000;
    Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96;
    Thermo Scientific PikoReal Cycler;
    Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR.


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