您好,欢迎来到上海翊圣生物科技有限公司官方网站!
400-6111-883
| EN
400-6111-883
Cy3 NHS Ester Cy3-N-羟基琥珀酰亚胺酯
产品货号:40777ES03
产品规格:1mg
产品价格:¥2938.00
类别:荧光探针/细胞染色

说明书下载

  • HB180710


    产品信息


    产品名称      

    产品编号

    规格

    储存

    价格(元)

    Cy3 NHS Ester Cy3-N-羟基琥珀酰亚胺酯

    40777ES03

    1mg

    -20℃避光干燥保存

    2938.00


    产品描述

    Cyanine 3(Cy3),是花青素荧光素染料家族的成员之一,是化学合成的聚甲炔染料。目前Cyanine系列染料以两种异构体的形式供货,一种是非磺化花青素(non-sulfonated cyanines),一种是磺化花青素(sulfonated cyanine)。两者的光谱性质几乎一致,因此大部分应用可相互替换,比如,都可用于标记DNA或蛋白等生物分子。两者的主要区别在于:磺化染料是水溶性的,在水相的标记反应体系内不需要使用有机共溶剂,并且降低染料在水中聚集的可能性,增强标记效率。

    本Cyanine 3(Cy3)是以磺化染料的形式供货,易溶于水,Ex=555 nm,Em=565 nm,具有明亮荧光,光稳定性强,pH非敏感性等优点,适用于标记多肽、蛋白以及核酸等生物分子,以通过后续荧光成像以及其他荧光生物学方法分析目的蛋白。

    本Cy3 NHS ester,即含N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide)活化基团的Cy3,可直接与生化分子上的氨基(-NH2)反应形成稳定的酰胺键,主要是伯胺。


    产品性质

    英文别名(English Synonym)

    Cyanine 3, monosuccinimidyl ester

    分子量(Molecular Weight)

    829.03

    外观(Appearance)

    紫色固体

    Ex/Em

    555nm/565nm

    溶解性(Solubility)

    溶于DMSO,DMF,水

    结构式(Structure)

    3.jpg


    运输和保存方法

    冰袋运输。-20℃干燥避光保存,有效期1年。


    注意事项

    1)NHS ester基团对湿度非常敏感,务必干燥保存产品。使用前产品需放到室温回温至少20min。

    2)NHS ester基团的水解发生在水溶性缓冲体系属于竞争性反应。对蛋白/多肽(浓度:1-1mg/ml)伯胺的连接反应建议在pH 7-9范围内进行。使用不含氨基的缓冲体系,pH 7-9。比如100 mM 磷酸钠,150 mM 氯化钠, pH 7.5; 100mM Hepes, pH 7.5。100 mM 碳酸钠/碳酸氢钠, pH 8-9;或100mM 硼酸缓冲液, pH 8-9。

    3)不要使用含伯胺的任何缓冲液,比如Tris,甘氨酸。

    4)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

     

    使用方法(用Cy3-NHS Ester 标记抗体)

    注意:可参考本方法进行多肽,蛋白或者其他分子的标记,需要根据具体的实验体系对合适的标记缓冲体系,样本浓度,染料浓度等参数做出合适的调整。

    1)用不含氨基的合适的缓冲液(eg.100mM磷酸钠,150mM NaCl, pH7.5)溶解抗体使其浓度达到1-5mg/mL。【】:如抗体中有残留Tris或 glycine 污染,则需透析或者脱盐到合适的缓冲液内。

    2)使用前,用适量去离子水或者无水DMSO溶解Cy3-NHS,使其摩尔浓度为抗体摩尔浓度的400倍,例如,待标记的IgG浓度为1mg/mL(eg 6.7µM),则溶解后Cy3-NHS的浓度为2.7mM;如待标记的IgG浓度为2.5mg/mL,则溶解后Cy3-NHS的浓度为6.75mM;

    3)向抗体中加入适量Cy3-NHS试剂,以达到预期的标记效率。【】:当用Cy 3 NHS ester标记抗体或其他蛋白,亮度最高的偶联物其染料/蛋白的比率为4-12,取决于特定的应用。过高比率会增加非特异性背景,丧失抗体特异性结合,导致聚集。建议根据应用优化标记比率。

    4)室温孵育60min(或更长);

    5)利用合适缓冲液透析或脱盐柱去除未反应的试剂;

    6)分别在280nm和550nm检测Cy3-抗体的吸光值;

    7)测定Cy3标记效率(DOL)和标记浓度。见下公式。

    公式一. 利用下面公式计算Cy3标记效率(DOL)及其浓度(mg/ml)

    Eq.1    Number of Cy3 dye per protein=molarity Cy3 dye / molarity protein

    Eq.2    [Molarity of Cy3 dye]=A555555

    Eq.3    [Molarity of protein]=A280C280

    Eq.4    mg/ml=[A280-(A555×0.08)/(E1%/10)]×dilution   factor

    【注】上述参数如下:

    A555=conjugate absorbance at   555±2nm

    ε555=molarextinction coefficient   Cys dye =150000M-1cm-1

    A280= conjugate absorbance at   280nm

    A280C =corrected conjugate   absorbance at 280nm= A280-( A555×0.08)

    ε280= molarextinction coefficient   protein(M-1cm-1)=MWp×E1%/10


    应用举例

    用高于抗体摩尔浓度20倍的Cy3-NHS标记 0.1 mL山羊IgG(浓度为1mg/mL)。标记后脱盐去除未标记染料,在PBS中测定(1:5稀释)测定其A280和A555:

    A280=0.2906 

    A555=0.9825

    另:山羊IgG分子量为150kDa, E1%=13.6 or 204000M-1cm-1

    计算DOL如下:

    By Equation 2      Molarity of Cy3 dye=0.9825/150000 M-1cm-1=6.55µM

    By Equation 3      Molarity of IgG =0.2906-(0.9825×0.08)/204000 M-1cm-1=1.039µM

    By Equation 1      number of Cy3 per IgG=6.55µM/1.039µM=6.3

    则计算Cy3-IgG protein 浓度为(mg/mL):

    By Equation 4     mg/ml=[0.2906-(0.9825×0.08)/1.36]×5=0.78mg/mL