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Hoechst 33342/PI Double Stain Kit Hoechst 33342/PI 双染试剂盒
产品货号:40744ES60
产品规格:100 T
产品价格:¥219.00
类别:荧光探针/细胞染色

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  • HB170616


    产品信息

    产品名称      

    产品编号

    规格

    储存

    价格

    Hoechst 33342/PI Double Stain Kit   Hoechst 33342/PI 双染试剂盒 

    40744ES60

    100 T

    -20 ºC~4℃

    219.00


    产品描述

    Hoechst 33342/PI 双染试剂盒(Hoechst 33342/PI Double Stain Kit)采用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)双染的方法以区分凋亡细胞和坏死细胞的试剂盒。其检测原理是:细胞核荧光染料Hoechst 33342可以穿透细胞膜,嵌入双链DNA后释放蓝色荧光。对于正常细胞,其可少许进入细胞膜使其染上低蓝色。而凋亡细胞由于细胞膜通透性增强,从而使得进入凋亡细胞内的Hoechst 33342明显多于正常细胞,荧光强度比正常细胞要高。另外,细胞发生凋亡时染色质会固缩,从而使得染料能更有效和聚集的结合于DNA,并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受损而不能有效的将Hoechst 33342排除到细胞外使其在细胞内的积累增加,这些特征都使得凋亡细胞经染色后荧光会比正常细胞明显增强。但细胞核荧光染料PI不能穿透细胞膜完整的正常细胞或凋亡细胞,即活细胞对PI染料拒染。而对于坏死细胞,其细胞膜的完整性在早期即已丧失,可被PI染色。

    经上述两种染料双染后,使用流式细胞仪或荧光显微镜检测时,正常细胞为弱红色荧光+弱蓝色荧光,凋亡细胞为弱红色荧光+强蓝色荧光,坏死细胞为强红色荧光+弱蓝色荧光。

    本试剂盒染色快速方便,可用一步法或者两步法进行染色。使用流式细胞仪检测时,无需稀释等配制过程,也无需再准备其它任何溶液。本试剂盒足够检测100个样品,每个样品的细胞数量可达105-106个。


    产品组分

    组分编号

    组分名称

    40744ES60(100T)

     保存方法

    40744-A

    Hoechst 33342 染色液 Hoechst 33342   Stain Solution

    500 μL

    4℃或-20℃避光保存

    40744-B

    PI 染色液 PI Stain Solution

    500 μL

    4℃或-20℃避光保存

    40744-C

    细胞染色缓冲液 Cell Stain Buffer

    100 mL

    4℃或-20℃保存


    运输与保存方法

    冰袋运输。 4℃保存,有效期6个月。-20℃保存,有效期12个月,建议分装避免反复冻融。


    注意事项

    1)Hoechst 33342、PI对人体有害,请注意适当防护;

    2)Hoechst 33342、PI需避光,整个实验过程尽量避光操作;

    3)荧光染料均存在淬灭情况,建议染色后需尽快检测;

    4)Hoechst 33342 与细胞孵育时间不宜过长,一般控制在20 min以内。太长容易引起该染料的发射光谱由蓝光向红光迁移,导致红色荧光和蓝色荧光比例改变。

    5)如果用于组织样品检测,则必须把组织消化制备成单细胞悬浮液后才可以进行检测。

    6)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


    操作步骤

    1. 样品准备

    贴壁细胞:小心吸除培养液至一个无菌离心管内备用。胰酶消化细胞,加入上述培养液,吹打所有贴壁细胞,并轻轻吹散细胞,收集至离心管内,4℃,1000 g 离心3-5 min,使细胞沉淀至管底。小心吸除上清,可留约50 µL培养液,以免吸到细胞。加入约1 mL预冷PBS(Yeasen,货号:60145ES76), 重悬细胞,并转移至1.5 mL无菌离心管。4℃,1000 g 离心3-5 min,使细胞沉淀至管底。小心吸除上清,可留约50 µLPBS,以免吸到细胞。轻弹离心管底适当分散细胞,避免细胞成团。

    悬浮细胞:4℃,1000 g 离心3-5 min,使细胞沉淀至管底。小心吸除上清,可留约50 µL培养液,尽量避免吸到细胞。加入约1mL预冷PBS, 重悬细胞,并转移至1.5 mL无菌离心管。4℃,1000 g 离心3-5 min,使细胞沉淀到管底。小心吸除上清,可留约50 µL PBS,以免吸到细胞。轻弹离心管底适当分散细胞,避免细胞成团。

    2. 重悬细胞:取上述收集好的105-106个细胞,加入0.8-1 mL细胞染色缓冲液重悬细胞。

    3. 细胞染色:

    3.1 一步法染色

    1) 加入5 µLHoechst 33342染色液。
    2)加入5 µLPI染色液。
    3) 轻轻混匀,冰浴或4℃孵育20-30 min。
    注:尽快进行后续荧光检测

    3.2 两步法染色:

    1)加入5 µLHoechst 33342染色液,置于37℃孵育5-15 min;

    2)置于冰水浴中冷却后,4℃ 1000 g离心3-5 min,吸除上层染色液;

    3)加入0.8-1 mL细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀;

    4)加入5 µLPI染色液,置于冰浴或4℃,孵育5-15 min。
    注:尽快进行后续荧光检测

    4.  检测与分析

    4.1  流式细胞仪检测:Hoechst 33342用氪离子激光激发紫外光,与 DNA结合后其最大激发波长为352 nm,发射波长为400- 500 nm(最大激发波长461nm),产生蓝色荧光;PI用氩离子激光激发荧光,与DNA结合后可用激发波长488 nm(最大激发波长535 nm),发射波长大于575 nm(最大激发波长617 nm),产生红色荧光,分析蓝色荧光对红色荧光的散点图或地形图。

    结果判断:在蓝色荧光对红色荧光的散点图上,可将细胞分为三个群:

    正常细胞:弱蓝色荧光+弱红色荧光【Hoechst 33342+/PI+】;

    凋亡细胞:强蓝色荧光+弱红色荧光【Hoechst 33342++/PI+】;;

    坏死细胞:弱蓝色荧光+强红色荧光【Hoechst 33342+/PI++】;。

    4.2 荧光显微镜观察:检测前4℃ 1000 g离心3-5 min,沉淀细胞,用PBS洗涤一次,再涂片观察红色和蓝色荧光。
            注:对于贴壁细胞使用荧光显微镜检测,可以不收集细胞,弃培养液,之后用PBS洗涤细胞一次,弃PBS洗涤液。然后直接依次按照上述比例加入细胞染色缓冲液、 Hoechst 33342染色液和PI染色液冰浴或4℃染色20-30 min。染色后PBS洗涤一次,然后在荧光显微镜下观察。Hoechst 33342用氪离子激光激发紫外光,与 DNA结合后其最大激发波长为352 nm,发射波长为400-500 nm(最大激发波长461 nm),产生蓝色荧光;PI用氩离子激光激发荧光,与DNA结合后可用激发波长488 nm(最大激发波长535 nm),发射波长大于575 nm(最大激发波长617 nm),产生红色荧光。


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