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Plant Tissue Direct PCR Kit
产品货号:10183ES50
产品规格:50 T
产品价格:¥353.00
类别:直扩PCR

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Plant Tissue Direct PCR Kit

    10183ES50

    50 T

    353.00

    Plant Tissue Direct PCR Kit

    10183ES70

    200 T

    1213.00


    产品描述

    植物组织直接PCR试剂盒是一款可直接对不同类型植物叶片进行PCR扩增的试剂盒,适应性广、稳定性强。试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系,可以快速的裂解多种植物样品并释放出基因组DNA,不需要除去蛋白、RNA或次生代谢产物等,即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外,样品使用量少,低至1 mg植物叶片即可进行实验。

    本试剂盒中提供的Plant Master Mix具有很强的扩增兼容性,能直接以待测样品裂解液为模板,进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液,包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,大大简化操作过程,降低污染几率。
    该试剂盒可用于转基因植株鉴定、植物基因分型等。


    产品组分

    类别

    编号

    组分

    产品编号/规格

    储存

    10183ES503(50 T)

    10183ES70(200 T)

    Part I

    10183-A

    Buffer P1

    3 mL

    10 mL

    室温或4℃

    10183-B

    Buffer P2

    3 mL

    10 mL

    4℃

    10183-C

    6× DNA Loading Buffera

    1.5 mL

    1.5 mL

    4℃或-20℃

    Part II

    10183-D

    Plant Master Mixb

    500 μL

    1 mL×2  

    -20℃

    a)6× DNA Loading buffer:不含SDS。

    b2× Plant Master Mix包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。


    运输方法

    冰袋运输。


    保存方法

    1. 试剂10183-A【Buffer P1】,在常温干燥条件下,可保存12个月,如需保存更长时间可置于4℃。低温保存,易出现沉淀,可平衡至室温或37℃水浴10 min,待沉淀溶解后,混匀使用。

    2. 试剂10183-B【Buffer P2】,中和裂解产物,使其不影响后续 PCR 反应。保存条件与Buffer P1一样。
    3. 试剂10183-C【6× DNA Loading Buffer】,可置于4℃或-20℃长期保存。

    4. 试剂10183-D【2× Plant Master Mix】-20℃保存,避免反复冻融。如果环境温度过高,2× Plant Master Mix 可能会变浑浊,可置于冰上放置1-2 min,待溶液澄清,上下颠倒混匀3-5次后再使用。

      


    操作方法

    本试剂盒根据不同实验需求提供了两种操作方法。直接法仅需要将一小片植物组织加入PCR反应体系即可;裂解法则是将少量含有植物组织的裂解产物加入PCR反应体系。其中,裂解法适合目的片段较长,扩增难度较大,以及需要对同一样本进行多次PCR扩增的实验。

    裂解法

    1. 取3-5 mg叶片(直径5-7 mm)组织,置于200 μL或1.5 mL离心管中。

    切勿加入过量叶片组织,以便酶解反应更顺利进行。

    2. 在离心管中加入50 μL Buffer P1,确保裂解液能够完全浸没叶片组织。

    3. 盖好离心管盖,95℃处理10 min。

    :加热后,若管壁上液体较多,可进行短暂瞬时离心。

    4. 加入50 μL Buffer P2,用微量移液器吹打或者涡旋混匀。

    5. 所得裂解液可4℃保存(5天)或-20℃长期保存或直接用于PCR扩增。

    直接法

    1. 在200 μL离心管中加入相应的2× Plant Master Mix,再添加对应的引物,并用ddH2O使其稀释1×(PCR体系配置见下表)

    2. 剪取1-2 mg叶片碎块(直径2-3 mm)加入配置好的1×PCR反应体系。

    :确保叶片碎块完全被PCR反应液浸没,切勿加入过量组织叶片。

    3. 根据优化好的PCR条件(退火温度等)进行PCR反应。

    4. 琼脂糖凝胶电泳检测结果。

    :建议使用试剂盒提供的6× DNA Loading Buffer,切勿使用含有SDS的Loading Buffer进行电泳。


    PCR反应鉴定——PCR反应体系

    组分

    体积(μL)

    体积(μL)

    终浓度

    2× Plant Master Mix

    10

    25

    Forward Primer (10 μM)

    0.5

    1

    0.2-0.25 μM

    Reverse Primer (10 μM)

    0.5

    1

    0.2-0.25 μM

    裂解产物(DNA模板) 

    4

    10

    -

    ddH2O

    To 20

    To 50

    -

    :各组分使用前应充分混匀。

    a)模板使用量:建议10-20%总体系。避免超过总体系的30%。

    b)引物终浓度0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。

    c反应体系:推荐使用20 μL或50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

    d体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。

    e对照反应:建议进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

     
    PCR反应鉴定——PCR反应条件

    循环步骤

    温度

    时间

    循环数

    预变性

    94℃

    5 min

    1

    变性

    94℃

    10 sec

    30-40

    退火

    50-65℃

    20 sec

    延伸

    72℃

    30 sec/kb

    终延伸

    72℃

    5 min

    1

    注:

    a)退火温度:请参考引物的理论 Tm 值,退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。

    b)延伸时间:需要根据片段的长度来确定,对于1 kb以内的DNA片段,建议延长时间为30 sec。


    注意事项

    1. 本试剂盒只适合于多糖多酚含量低的植物叶片样本,如小麦、水稻、烟草、玉米、大豆、油菜等。不适合多糖多酚含量高的植物样本。

    2. 建议使用新鲜采取的叶片组织,若为长期冷冻组织,应尽量避免反复冻融,否则会导致模板的降解,影响PCR效率。叶片组织以幼嫩为宜,若为成熟的叶片,避免使用叶片主脉部位组织。

    3. 电泳检测时,切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则,电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带,影响实验结果。

    4. 建议扩增片段长度1 kb以内,以便扩增效率最佳。

    5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

    常见问题与解决方法

     

    常见问题

    可能原因

    解决方法

    阳性对照、待测样本均无条带。

    PCR反应体系或反应条件不合适。

    使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。

    PCR试剂保存不当失去活性。

    2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。

    引物设计问题。

    尝试重新设计引物进行检查。

    阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。

    叶片中多糖多酚含量较高,裂解混合液呈棕黄色甚至棕红色。

    本试剂盒不适合多分多糖含量较高的样品。

    裂解液、中和液加入比例不当,裂解混合液影响PCR体系的pH值。

    正常条件下,中和后的裂解混合液的 pH 应该在7-8左右(裂解产物和Buffer P2严格按照1:1的量进行中和)。

    样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。

    裂解混合液液可在4℃保存5天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。

    模板加入量不适合。

    在反应体系5-20%范围内优化模板加入量。

    PCR循环数不足。

    适当增加PCR的循环数,推荐35-40循环为佳。因模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。

    非特异性扩增

    PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。

    增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。

    PCR引物错配。

    重新设计PCR引物。

    配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。

    PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。

    阴性对照出现目的条带

    操作工具或试剂污染。

    实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

    样本间交叉污染。

    每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。


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