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Animal Blood Direct PCR Kit全血直接PCR试剂盒
产品货号:10182ES50
产品规格:50 T
产品价格:¥326.00
类别:直扩PCR

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR试剂盒

    10182ES50

    50 T

    326.00

    Animal Blood Direct PCR Kit 全血直接PCR试剂盒

    10182ES70

    200 T

    755.00


    产品描述

           全血直接PCR试剂盒(Animal Blood Direct PCR Kit)可以直接对全血样本进行PCR,无需DNA提取或样品处理,大大降低了污染风险,缩短了检测时间。

    试剂盒中包含配方优化的2× Blood Master Mix,具有很强抑制物耐受性,人血的模板最大加入量可达45%,鼠血的可达20%,可以灵敏的扩增血液样本中基因组和外源目的DNA片段。2× Blood Master Mix包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,扩增产物末端加A,适用于Hieff Clone™快速克隆试剂盒(货号10907ES60/10908ES60)。

    该试剂盒可用于直接扩增的血样类型包括:新鲜血液、4℃贮存血液、冷冻血液以及储存在Whatman 903®和FTA®商用卡上的干血渍,且兼容所有常规抗凝剂(EDTA、柠檬酸盐、肝素等)。适用样本来源包括人血、鼠血、鸡血、鸟血、牛血、狗血等。


    产品组分

    编号

    组分

    产品编号/规格

    10182ES50(50 T)

    10182ES70(200 T)

    10182-A

    2× Blood Master Mixa

    500 µL

    1 mL× 2

    10182-B

    6× DNA Loading bufferb

    1.5 mL

    1.5 mL

    a)2× Blood Master Mix包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。

    b6× DNA Loading buffer:不含SDS。


    运输和保存方法

    冰袋运输。-20℃保存。避免反复冻融。


    操作方法

    1. PCR反应体系配制

    组分

    体积(μL)

    体积(μL)

    终浓度

    2× Blood Master Mix

    10

    25

    Forward Primer (10 μM)

    0.5

    1

    0.2 μM

    Reverse Primer (10 μM)

    0.5

    1

    0.2 μM

    抗凝全血

    X

    X

    -

    ddH2O

    To 20

    To 50

    -

    :使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。

    a)模板使用量:进行基因组上的目的片段检测,建议使用少量的血液量作为模板;检测血液样本中某种病毒或细菌等的目的片段,建议扩大PCR体系并使用较大量的血液模板。血液模板最多占PCR体系的45%(人血)、20%(鼠血)。若模板使用含有血液的采集卡,可截取直径1-4 mm的血点,直接加入20-50 μL PCR反应体系进行扩增。

    b引物浓度:通常引物终浓度为0.2 μM,也可以根据情况在0.1-0.5 μM之间进行调整。

    c反应体系:推荐使用20 μL或 50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性

    d体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。

    2. PCR反应条件设置

    循环步骤

    温度

    时间

    循环数

    预变性

    95℃

    5 min

    1

    变性

    95℃

    10 sec

    30-40

    退火

    50℃~65℃

    20 sec

    延伸

    72℃

    30 sec/kb

    终延伸

    72℃

    5 min

    1

    a预变性95℃,5 min可以让白细胞裂解,释放可用于PCR扩增的基因组DNA。请勿缩短时间或降低温度。

    b退火温度:退火温度设置为引物Tm值即可。然而,使用高的退火温度可以有效减少非特异性扩增,并提高全血模板的扩增效率。因此,如扩增产物特异性较差,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板最适退火温度。

    c延伸时间:按30 sec/kb设定,如不足30 sec,设置30 sec即可。

    d扩增循环数35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加。

    3. 扩增产物分析

    PCR完成后,建议将反应液于1000× g (大约4000 rpm) 离心1~3 min以沉淀血细胞碎片,之后取上清进行下游分析。该步骤可有效去除多种血液组分。当使用高浓度血液模板时此步尤为重要,因为经过PCR循环,反应管中会存在大量的血细胞碎片。这些碎片会干扰下游的检测,如琼脂糖电泳检测。注意:由于血液本身的原因,PCR 结束后在 PCR 管的底部会出现透明凝胶状物质,此为正常现象。

    4. 对照反应

    PCR结果分析时,不管是阳性结果或阴性结果,如果没有对照反应,都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析,建议在进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

    4.1 阳性对照反应体系

    组分

    体积(μL)

    体积(μL)

    终浓度

    2× Blood Master Mix

    10

    25

    Forward Primer (10 μM)

    0.5

    1

    0.2 μM

    Reverse Primer (10 μM)

    0.5

    1

    0.2 μM

    模板DNA

    X

    X

    100-200 ng

    ddH2O

    To 20

    To 50

    -

    a模板DNA:选用样本纯化的DNA。

    b引物的选择:建议选择该样本较易扩增的基因的引物,如 β-actin 基因或 GAPDH 等。

    4.2 阴性对照

    PCR反应体系被污染会导致PCR结果出现假阳性,需要设置阴性对照来排除。将使用的移液器枪头浸泡在2× Blood Master Mix中,添加引物,ddH2O进行PCR扩增;另取ddH2O作为模板,用目的基因引物进行PCR扩增,以排除PCR体系是否被污染和实验是否有其他污染源。


    注意事项

    1. 尽量使用新鲜抗凝血。若冻存血,应避免反复冻融。

    2. 解冻后2× Blood Master Mix可能出现浑浊,冰上放置1-2 min,待溶液澄清后,上下颠倒混匀,不影响试剂性能。

    3. 电泳检测时,切勿使用含有 SDS 的Loading Buffer,否则在电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带,影响实验结果。
    4. 建议扩增片段长度1 kb以内,以便扩增效率最佳。

    5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

    常见问题与解决方法


    常见问题

    可能原因

    解决方法

    阳性对照、待测样本均无条带。

    PCR反应体系或反应条件不合适。

    使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。

    PCR试剂保存不当失去活性。

    2× PCR Mix应保存于-20℃,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4℃短时间存放。

    引物设计问题。

    尝试重新设计引物进行检查。

    阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。

    血液样本保存不当,基因组DNA降解。

    抗凝全血可在4℃保存2-8天,需长时间保存可将样本置于在-20℃或-70℃冻存,并避免反复冻融。

    模板加入量不适合。

    可在PCR体系10%-30%范围内优化血液加入量;若是扩增血液样本中的病毒或细菌DNA片段,可将模板量增加至30%-40%。

    PCR循环数不足。

    适当增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,一般PCR反应要比用纯化的 DNA模板多5-10个循环为佳。

    非特异性扩增

    PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。

    增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。

    PCR引物错配。

    重新设计PCR引物。

    配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。

    PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。

    阴性对照出现目的条带

    操作工具或试剂污染。

    实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。


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