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Mouse Tissue Direct PCR Kit
产品货号:10181ES50
产品规格:50 T
产品价格:¥326.00
类别:直扩PCR

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

    规格

    价格(元)

    Mouse Tissue Direct PCR Kit

    10181ES50

    50 T

    326.00

    Mouse Tissue Direct PCR Kit

    10181ES70

    200 T

    755.00


    产品描述

    小鼠组织直接PCR试剂盒是一款可快速对小鼠鼠尾、鼠耳、肌肉等组织样本进行PCR扩增的试剂盒。本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系,可以快速的裂解样品并释放出基因组DNA不需要除去蛋白、RNA等,即释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外,样品使用少,低至5 mg小鼠组织或2-5 mm鼠尾即可进行实验。

    本试剂盒中提供的 Mouse Master Mix具有很强的扩增兼容性,能直接以待测样品裂解液为模板,进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液,包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,大大简化操作过程,降低污染几率。
    该试剂盒可用于转基因型鉴定、动物基因分型等。


    产品组分

    类别

    编号

    组分

    产品编号/规格

    储存

    10181ES50(50 T)

    10181ES70(200 T)

    Part I

    10181-A

    Buffer MP

    5 mL

    20 mL

    室温或4

    10181-B

    Protease Plus

    220 μL

    880 μL

    4

    10181-C

    6× DNA Loading Buffera

    1.5 mL

    1.5 mL

    4℃或-20

    Part II

    10181-D

    Mouse Master Mixb

    500 μL

    1 mL×2

    -20

    a)6× DNA Loading buffer:不含SDS。
    bMouse Master Mix包含Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。


    运输方法

    冰袋运输。


    保存方法

    1. 试剂10181-A【Buffer MP在常温干燥条件下,可保存12个月,如需保存更长时间可置于4℃。低温保存,易出现沉淀,可平衡至室温或37℃水浴10 min,待沉淀溶解后,混匀使用。
    2. 试剂10181-B【Protease Plus】,具有独特配方,为保证其更好的活性和稳定性,建议4℃保存,切勿置于-20℃

    3. 试剂10181-C【6×DNA Loading Buffer】,可置于4℃或-20℃长期保存。

    4. 试剂10181-D【2× Mouse Master Mix】-20℃保存,避免反复冻融。


    操作方法

    样品基因组DNA释放

    1. 在离心管中加入100 μL Buffer MP,4 μL Protease Plus,轻轻涡旋混匀。

    Buffer MP与Protease Plus混合后尽快使用不宜长期保存

    2. 5-10 mg动物组织或2-5 mm鼠尾,置于上述离心管中,轻轻涡旋混匀。

    组织应尽量剪碎,以便酶解反应顺利进行。

    3. 65孵育10-30 min,然后95处理5 min。

    65孵育,一般10 min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难酶解,可将时间延长至30 min。组织块不需完全酶解,残余的部分在后续离心步骤中可被除去。

    4. 12000 rpm离心5 min。

    5. 将上清转移至新的离心管,4-20保存或直接用于PCR扩增。


    PCR反应鉴定——PCR反应体系

    组分

    体积(μL

    体积(μL

    终浓度

    ddH2O

    To 20

    To 50

    -

    Mouse Master Mix

    10

    25

    Forward Primer (10 μM)

    0.5

    1

    0.2-0.25 μM

    Reverse Primer (10 μM)

    0.5

    1

    0.2-0.25 μM

    裂解产物(DNA模板) 

    2

    5

    -

    :各组分使用前应充分混匀

    a)模板使用量:建议1-10%总体系。避免超过总体系的20%。

    b)引物终浓度0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。

    c反应体系:推荐使用20 μL50 μL,以保证目的基因扩增的有效性和重复性

    d体系配制:配制好PCR反应体系,置于涡旋仪上涡旋混匀,瞬时离心将反应液集于管底。


    PCR反应鉴定——PCR反应条件

    循环步骤

    温度

    时间

    循环数

    预变性

    94

    3 min

    1

    变性

    94

    10 sec

    30-40

    退火

    50-65

    20 sec

    延伸

    72

    30 sec/kb

    终延伸

    72

    5 min

    1

    a)退火温度:请参考引物的理论Tm值,退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。

    b)延伸时间30 sec/kb设定,如不足30 sec,设置30 sec即可。

    c扩增循环数35个循环已可以扩增足量产物。太多的循环将会导致非特异性扩增增加。


    对照反应

    PCR结果分析时,不管是阳性结果或阴性结果,如果没有对照反应,都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析,建议在进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。


    注意事项

    1. 为了避免样本间交叉污染,每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液中,反复洗刷数次进行清洗,然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便,也可准备多个取样器材,在使用完后进行统一清洗,确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。

    2. 建议使用新鲜采取的动物组织,若为长期冷冻组织,应尽量避免反复冻融,否则会导致模板的降解,影响PCR效率。

    3. 试剂Buffer MP若低温保存,易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间,也可在37水浴中预热10 min,以溶解沉淀,混匀后再使用。

    4. 建议扩增片段长度1 kb以内,以便扩增效率最佳。

    5. 电泳检测时,切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则,电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带,影响实验结果。

    6. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。


    常见问题与解决方法

     

    常见问题

    可能原因

    解决方法

    阳性对照、待测样本均无条带

    PCR反应体系或反应条件不合适。

    使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。

    PCR试剂保存不当失去活性。

    2× PCR Mix应保存于-20,使用时避免反复冻融。若使用频繁,可在4短时间存放。

    引物设计问题。

    尝试重新设计引物进行检查。

    阳性对照有目的条带,待测样本无条带或条带弱。

    不当储存或长期储存引起试剂活性丧失。

    使用新鲜的试剂。

    加入组织裂解液过量。

    增大反应体系,或减少裂解液的用量。

    样本裂解混合液保存不当或保存时间过久,DNA基因组已经降解。

    裂解混合液液可在4℃保存2-3天,尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。

    模板加入量不适合。

    在反应体系10-20%范围内优化模板加入量。反应效性能较差时,可以降模板浓度调节到低于10%的范围。

    PCR循环数不足。

    增加PCR的循环数,推荐在35-40循环为佳。因为模板复杂,PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。

    非特异性扩增

    PCR退火温度太低,循环数、引物浓度或模板浓度太高。

    增加PCR退火温度,降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。

    PCR引物错配。

    重新设计PCR引物。

    配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。

    PCR反应体系的配制在低温下进行,配制完成后尽快进行PCR扩增反应。

    阴性对照出现目的条带

    操作工具或试剂污染。

    实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

    样本间交叉污染。

    每个取样器只对一个样本使用;或取完一个样本后,将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中,反复涮洗,然后用干净的纸巾擦干残液。


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