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Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit 细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒
产品货号:20127ES50
产品规格:50T
产品价格:¥835.00
类别:蛋白抽提

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  • 产品信息

    产品名称      

    产品编号

    规格

    储存

    价格(元)

    Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit 细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒

    20127ES50

    50T

    -20℃

    835.00

    Membrane and Cytosol Protein Extraction Kit 细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒

    20127ES60

    100T

    -20℃

    1435.00


    产品描述

    细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒用于快速便捷分离细胞/组织细胞膜和细胞浆蛋白,抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的蛋白,也包括线粒体膜、内质网膜以及高尔基体膜等上的膜蛋白。主要工作原理:通过匀浆适度破碎细胞,经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀,随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清,然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。整个过程仅需约90 min即可完成,抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE,Western、酶活性测定等后续实验。

    膜蛋白抽提试剂中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和EDTA等,后续不适合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受这些抑制剂影响的酶的活性测定,但抽提获得的膜蛋白或细胞浆蛋白适合用于检测蛋白的磷酸化水平。

    按照说明书步骤的用量(细胞2-5×107个;组织约100 mg),20127ES50/20127ES60可分别进行50个和100个样品的抽提,具体用量可根据不同的样品体积进行调整。


    品组分

    组分编号

    组分名称

    产品编号/规格

    20127ES50(50T)

    20127ES60(100T)

    20127-A

    Reagent A试剂A

    50 mL

    100 mL

    20127-B

    Reagent B试剂B

    15 mL

    30 mL


    运输和保存方法

    冰袋运输。-20℃保存,有效期1年。


    注意事项

    1)客户需自备PMSF,PMSF需现配现用,建议在抽提试剂加入到样品前2-3 min加入,以防失效。
    2)利用本试剂盒抽提到的细胞膜/细胞浆蛋白可直接用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(Yeasen Cat#20201)测定其浓度,但不适合用Bradford法测定。

    3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


    使用方法

    室温融解并混匀试剂A和B,融解后立即置于冰上。取适量的试剂A和B备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使其最终浓度为1 mM。


    1 样品准备

    1)细胞样品
    细胞收集

    贴壁细胞:培养细胞约2-5×107个,PBS清洗一遍,用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞,并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞,吸除上清,留下细胞沉淀备用。
    注:尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。 

    悬浮细胞:培养细胞约2-5×107个,离心收集细胞,吸除上清,留下细胞沉淀备用。

    ② 细胞清洗

    用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀,取少量细胞用于计数,剩余细胞4℃,600 g离心5 min沉淀细胞。弃上清,随后4℃,600 g离心1 min,以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞,尽最大努力吸尽残留液体。

    ③ 细胞预处理:把1 mL试剂A(含PMSF)加入至上述细胞中,轻轻并充分悬浮细胞,冰浴放置10-15 min。

    2)组织样品

    取约100 mg组织,用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1 mL试剂A(含PMSF),轻轻悬浮组织碎片,冰浴放置10-15 min。

    注:如果组织样品比较少,也可以使用更少的组织量,例如30-50 mg,后续试剂的用量及操作步骤不变;组织用量较少时,最后获得的膜蛋白也较少。


    2 样品的破碎及破碎效果的鉴定

    ① 样品匀浆:把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中,匀浆约30-50下。【匀浆效果与细胞类型和组织类型相关,不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同,需自行优化。】

    ② 通常在匀浆30次后取约2-3 µL匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察,如见细胞核周晕环(A shiny ring around the nuclei)或完整的细胞形态,说明细胞仍完整。如果有70-80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态,说明细胞已经充分破碎,则进行下一步实验。否则,重新匀浆10-30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数,通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关,需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。

    注:如果没有适当的玻璃匀浆器,对于培养的细胞也可以采用反复冻融法来破碎细胞。把样品在液氮和室温依次反复冻融两次,然后取少量样品在显微镜下检测细胞破碎的程度。如果细胞破碎的程度不足70%,可增加冻融次数,直到细胞破碎的程度大于70%。


    3 去除细胞核和未破碎的细胞

     4℃,700 g离心10 min,小心收集上清液至一新的离心管中。

    注:吸取上清时切勿接触沉淀!可以有约30-50 µL上清液残留不予吸取,以保证吸取的上清液有较高的纯度。


    4 沉淀细胞膜碎片

    4℃,14,000 g离心30 min,以沉淀细胞膜碎片。


    5 收集细胞浆蛋白

    吸取上清至1新的离心管中,即为细胞浆蛋白,可-70℃保存备用。吸取上清时可以有30-50 µL上清残留,以避免接触沉淀导致上清样品被污染。


    6 抽提膜蛋白

    4℃,14,000 g离心10 s,尽最大努力吸尽上清。可以轻轻触碰到沉淀,甚至吸走很少量的沉淀。加入试剂B 200 µL(如有必要,也可加大到300 µL),最高速剧烈Vortex 5 s重悬沉淀,冰浴5-10 min。重复前述步骤的vortex和冰浴孵育1-2次,以充分抽提膜蛋白。随后,4℃,14,000 g离心5 min,收集上清即为细胞膜蛋白溶液。可-70℃保存备用。对于一些有特殊用途的膜蛋白,可自行配制适当的膜蛋白抽提试剂进行膜蛋白抽提。