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Hifair™ Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)
产品货号:11121ES60
产品规格:100 T
产品价格:¥935.00
类别:逆转录酶

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  • 产品信息

    产品名称

    产品编号

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    价格(元)

    Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

    11121ES60

    100 T

    -20

    935.00


    产品描述

    Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair®  Reverse Transcriptase而开发。该酶热稳定性大幅度提高,可耐受高达50的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升,可扩增长达10 kbcDNA

    该试剂盒包含gDNA digester,可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染,保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物:Random Primers N6 oligo (dT)18,用户可根据需要,选择Random Primers N6Oligo (dT)18Gene Specific Primers作为逆转录引物,合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

    产品组分

    编号

    组分

    产品编号规格11121ES60 (100 T)

    11121-A

    RNase free ddH2O

    2×1 mL

    11121-B

    5×gDNA digester Buffer

    200 μL

    11121-C

    gDNA digester

    100 μL

    11121-D

    5×Hifair® Ⅱ Buffer plus

    400 μL

    11121-E

    Hifair® Ⅱ Enzyme Mix

    200 μL

    11121-F

    dNTP10 mM

    100 μL

    11121-G

    Oligo (dT)18 (50 μM)

    100 μL

    11121-H

    Random Primers N6 (50 μM)

    100 μL

    【注】:15×Hifair® Ⅱ Buffer plus包含gDNA digester抑制剂;2Hifair® Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor


    运输与保存

    干冰运输。-20保存。

    注意事项

    1)反应液的配制应在冰上操作完成,操作过程应避免RNase污染

    2)建议RNA是溶于水而不是TE因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应

    3)可以不经过基因组去除步骤,直接进行逆转录,这样所得到的结果与使用Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis KitCat No. 11119ES)效果一致。但是请勿将gDNA digester11119ES中的5×Hifair® Ⅱ Buffer配套使用,因其不含终止gDNA 去除反应的成分,会影响反转录和后续的qPCR实验。

    关于逆转录引物的选择

    1) 如果模板为真核生物来源,建议选择Oligo (dT)18 ,与真核生物mRNA3’ Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA 
    2)原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。
    3Random Primers N6适用性较广,适用于mRNArRNAtRNAsmall RNALncRNA等模板
    4使用Random primers N6,进行2 kb以下的cDNA合成时,Random primers N6的使用量为 1-2 μL2 kb 以上的cDNA合成时,Random primers N6 的使用量为0.4-1 μL

    第一链cDNA合成操作步骤

    一、若实验需要去除残留基因组DNA

    1. RNase free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42孵育2 min

    组分

    使用量

    RNase free ddH2O

    To 10 μL

     gDNA digester Buffer

    2 μL

    gDNA digester

    1 μL

    模板RNA

    Total RNA: 1 ng -5 μgmRNA: 1 ng-500 ng

    2. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)

    组分

    使用量

    RNase free ddH2O

    To 20 μL

    上一步的反应液

    10 μL

     Hifair® Ⅱ Buffer plus

    2 μL*

    Hifair® Ⅱ Enzyme Mix

    2 μL

    dNTP10 mM

    1 μL

    Random Primers N6 (50 μM)  

    1 μL

    or Oligo (dT)18 (50 μM)

    or Gene Specific Primers (2 μM)

    or 1 μL

    or 1 μL

    【注】1)逆转录引物:荧光定量实验可以只使用Random Primers N6;也可以1:1Oligo (dT)18混合使用,效果更好

    25×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量*gDNA digester buffer的影响,本体系中只需要加2 μL

    3)建议先加入5×Hifair® Ⅱ Buffer plus混匀后再添加反转录引物,以保证完全抑制gDNA digester的活性。

    3. 逆转录程序设置

    温度

    时间

    25

    5 min

    42

    30 min

    85

    5 min


    】:逆转录温度:推荐使用42。对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到50

    4.
    逆转录产物可-20短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80保存,避免反复冻融。

    二、若实验无需去除基因组DNA

    1. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)

    组分

    使用量

    RNase free ddH2O

    To 20 μL

    模板RNA

    Total RNA: 1 ng -5 μgmRNA: 1 ng-500 ng

     Hifair® Ⅱ Buffer plus

    4 μL*

    dNTP10 mM

    1 μL

    Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers N6 (50 μM)

    1 μL

    Hifair® Ⅱ Enzyme Mix

    2 μL

    【注】1)逆转录引物:荧光定量实验可以只使用Random Primers N6;也可以1:1Oligo (dT)18混合使用,效果更好

    25×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量*因无gDNA digester buffer的影响,本体系中需要添加4 μL

    【可选步骤】:针对复杂模板,建议RNAH2O、反转录引物在65保温5 min 后,冰上迅速冷却。然后再加入反转录酶和Buffer。

    2. 逆转录程序设置参照上述基因组去除后的逆转录程序


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