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得不到阳性克隆?可能是忽视了这些细节……



过去


提起“分子克隆”或“载体构建”这两个词,大家可能最先想到的是传统酶切酶连法,即用限制性内切酶产生黏性末端,通过碱基互补配对,T4 DNA Ligase连接两个片段的克隆方法。



近年


“同源重组技术”逐渐受到科研人员的欢迎,如翊圣Hieff Clone®一步法快速克隆技术。相比之下,同源重组技术操作更加简单,不受到酶切位点的限制,可一次进行多个片段的拼接,大大的提高了克隆效率。


虽然同源重组技术操作简单,但毕竟实验过程是环环相扣的,一旦某个细节处理不好,都可能导致实验失败。为此,小编精心整理了同源重组实验的常见问题,并给出了可能的原因和解决方案希望新手们在遇到类似问题时可快速判断可能的原因,节省时间,更顺利的完成实验。




克隆常见问题与解决




常见问题分类:

无克隆、假阳性、菌落PCR无条带、酶切鉴定多条带



无克隆



出现无克隆的现象,可能的原因主要是连接不成功或连接成功,但转化失败。具体原因分别如下:

1、 连接不成功

可能原因

解决方法

1)引物设计错误。

1)设计原则:同源臂(15-25 bp,GC含量40-60%)+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物。

2)判断方法:可用翊圣无缝克隆引物设计软件核对

2)载体与目的片段使用比例失调。

1)载体和目的片段浓度测定方法:常用吸光度法或琼脂糖电泳法。

2)载体与目的片段添加比例:

①单片段建议:最适载体与目的片段摩尔比为1:2-1:3,载体使用量为0.03 pmol;目的片段使用量为0.06-0.09 pmol。

②多片段建议:最适DNA使用量为每片段(含线性化载体)0.03 pmol。

3)载体与目的片段不纯。

1)推荐对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。

2)纯化产物建议溶解在pH8.0的ddH2O中保存。

3)若为未纯化的DNA,加入总体积不超过反应体系体积1/5。

4)操作问题或试剂盒失效。

建议做试剂盒附带的阳性对照实验。判断方法:

1)若阳性对照有克隆并检测为阳性,则排除试剂盒问题。

2)若阳性对照无克隆,可能是操作问题或试剂盒失效,建议换其他人或换试剂盒进行阳性对照实验,进一步确定问题。

2、 连接成功,但无克隆

可能原因

解决方法

1)感受态细胞效率低,如< 107 cfu/μg。

建议用转化效率>107 cfu/μg的感受态细胞。

判断方法:可转化0.1ng质粒(如PUC19),观察克隆数,若生长大于1000个菌斑,则转化效率大于107cfu/μg。

2)抗生素种类错误。

建议将未线性化载体转化涂板。

判断方法:若未长克隆,则可能是抗性种类错误或浓度过高。需检查质粒图谱确认抗性或确认最适浓度。



假阳性



出现假阳性的情况,主要表现有两种,克隆不含插入片段或含有错误的插入片段。具体原因分别如下:

1、克隆不含插入片段(空载)

可能原因

解决方法

1)载体线性化不完全。

建议将已制备的线性化的载体转化涂板。  

判断方法:如果长克隆较多,则表示线性化不完全。建议优化酶切体系。

2)体系中混入了相同抗性的环状质粒。

1)产生原因:

①以反向PCR方式进行载体线性化,残留环状质粒模板导致。

②目的基因PCR模板为与载体相同抗性的环状质粒,残留环状 质粒模板导致。

2)判断方法:将已制备的线性化载体和目的片段分别转化涂板,如果长克隆较多,则表示有相同抗性的环状质粒混入。建议PCR扩增产物先用DpnI 消化模板后,再进行胶回收纯化处理或直接进行胶回收纯化处理,去除残留的环状模板质粒导致的假阳性。

2、克隆含有错误的插入片段

可能原因

解决方法

1)PCR产物混有非特异扩增产物。

1)可能情况:PCR扩增目的基因时有非特异条带出现,未进行胶回收纯化。

2)解决方案:

①优化PCR体系,提高特异性;

②胶回收PCR产物;

③鉴定更多的克隆。

2)片段缺失。

1)可能情况:载体或片段有多个同源重复序列。

2)解决方案:借助网站或软件进行序列比对(如NCBI, Vector NTI等)。



菌落PCR无条带


出现菌落PCR无条带的现象,可能与PCR扩增或重组连接有关,具体原因分别如下:

可能原因

解决方法

1)菌落PCR引物错误。

建议用载体的通用引物进行菌检,或至少使用一条通用引物。

2)PCR体系或程序不合适。

1)可能情况:用目的片段引物和载体通用引物扩增都无产物。

2)解决方案:

①优化PCR体系、程序;

②提取质粒,以质粒做模板PCR验证;

③换酶切法鉴定克隆。

3)连接失败。

1)判断方法:目的引物或一端载体通用引物,另一端目的引物扩增无条带,但载体通用引物扩增有条带,且大小符合空载。2)可能原因:载体线性化不完全。建议优化酶切体系。






酶切鉴定多条带


可能原因

解决方法

重组载体上有多个相同的酶切位点。

1)换其他酶切位点进行酶切鉴定。

2)更换克隆鉴定方法,如换成菌落PCR或测序鉴定。


以上就是翊圣生物为大家整理的同源重组的常见问题及相应的建议,希望对大家有所帮助。如果还有其它更多关于同源重组的问题,欢迎留言或来电。如果您之前在用传统酶的切酶连技术,现对高效的同源重组技术跃跃欲试,那赶快行动起来吧!





产品推荐




翊圣生物将提供高体验满意度的产品解决方案作为责任,追求从实验操作者的视角考量产品性能!在此考量下,为大家推荐以下匠心出品——Hieff CloneTM克隆系列产品。该系列产品克隆效率显著提升,可达95%以上。基于同源重组的方式,该系列产品无需考虑酶切位点,适用于任何载体和任意片段的连接。同时兼具连接反应时间短(20 min)、操作简单等优势。

产品定位

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Hieff Clone
TM一步法克隆


产品优势
● 无需考虑酶切
位点:不受插入片段酶切位点的限制,适用于任何载体;插入片段兼容粘性或平末端。

● 设计简单:在插入片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

● 快速50℃,20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

● 应用广泛:可用于单片段或多片段定向克隆,也可结合Canace高保真酶,应用于定点突变。


客户反馈数据

高效、快速单片段连接

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注. A: 阴性对照转化平板; B: 重组质粒转化平板; C: 1和2分别为原始载体和线性化载体浓度检测电泳图; D: 目的片段的浓度检测电泳图; E: 目的片段的菌落PCR鉴定电泳图; F: 1为重组质粒的酶切鉴定电泳图, 2为原始质粒酶切对照图; M: DL10000。pCAMBIA1300载体: 10217bp, 目的片段: 2352bp。


高效、快速多片段连接

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注. A: 重组质粒转化平板; B: 1为载体酶切后琼脂糖凝胶电泳图; C: 菌落PCR验证结果, 其中1为原始质粒对照电泳, 2-5为重组质粒, 仅检测867bp的一个目的片段, 6为假阳性; D: 阳性克隆测序结果; M:Marker II。pBR322载体:3996bp,目的片段:576bp+867bp+915bp+647bp。


发表部分文献

[1]. Liu C X, Li X, Nan F, et al. Structure and degradation of circular RNAs regulate PKR activation in innate immunity[J]. Cell, 2019.(IF 36.616)

[2]. Wang Y, Hu SB, et al. Genome-wide screening of NEAT1 regulators reveals cross-regulation between paraspeckles and mitochondria. Nat Cell Biol.2018 Oct;20(10):1145-1158.(IF 20.06)

[3]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.(IF 37.205)


Hieff CloneTM TOPO克隆


产品优势

平末端和A末端PCR产物均可在瞬间(几秒钟-5分钟)完成连接;

无需并与和热休克,室温5分钟内完成转化;37℃ 10分钟复苏可以涂板;


客户反馈数据

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发表部分文献

[1]. Jiang, Y., et al., Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J]. Science, 2017.(IF 37.205)

[2]. Xing, Y.H., et al., SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017. 169(4): p. 664-678.e16.(IF 30.41)

[3] Li X, Liu C X, Xue W, et al. Coordinated circRNA biogenesis and function with NF90/NF110 in viral infection[J]. Molecular Cell, 2017. (IF 14.7)





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往期精彩回顾


1、分子克隆知多少

2、同源重组克隆操作攻略(简化版)