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干货分享 | 磁珠常见问题与解决方案

高通量测序技术的跨越式发展,使测序能力大幅上升在整个NGS工作流程中,磁珠是必不可少的产品。

磁珠通过磁颗粒活性基团在一定条件下可与核酸结合和解离的原理,将样本中目的片段分离。可实现对核酸样本的高通量自动化操作,广泛应用于基因测序以及分子诊断领域。

看起来很简单的纯化/分选实验,却在实际实验中有各种意外的情况。那关于磁珠产品选择和产品使用方面有什么需要注意的事项呢?接下来小翊将从磁珠的外观、储存、应用和使用效果逐一对症分析,希望能帮助大家了解磁珠实验中的那些事。


磁珠外观


Q:如何从磁珠的外观区分磁珠是否正常

A正常磁珠静置时,微珠与buffer分层,聚集在瓶身底部,使用前震荡混匀,微珠均匀分布在buffer中。非正常磁珠由于 β-巯基乙醇、DTTpH差值大等因素,影响磁珠的均一性,使得磁珠粘稠,聚集成块或出现挂壁的现象。

图片.png

1. 正常磁珠外观图

图片.png 

2. 非正常磁珠外观图


磁珠储存

Q 不小心将磁珠放到-20℃,但未结冰,是否可以继续使用?

A不建议使用因为低温会破坏磁珠的结构,使得磁珠的抓取效率降低,影响磁珠回收性能。

Q:磁珠未开封的时候4℃保存,开封后一直室温保存使用,是否会影响磁珠的回收性能?

A室温放置对磁珠的回收性能会有一定影响,不建议室温放置太久,使用完后建议4保存PEG分离效果易受pH、温度等影响


磁珠应用

Q:磁珠分选的原理是什么?

A:第一轮磁珠结合分子量较大的DNA,通过丢弃磁珠去除这部分产物;第二轮磁珠结合剩余产物中分子量较大的DNA,通过丢弃上清去除分子量较小的DNA

初始样品中的很多组分都会干扰双轮磁珠分选效果。因此,当分选方案执行位置不同时,双轮磁珠使用量也不尽相同。

Q:产品的主要应用是什么?

A:产品主要应用于高通量测序DNA片段的纯化和分选。对于PCR或者酶切DNA产物的纯化也可以使用。可以有效去除dNTP,引物,引物二聚体,接头,接头二聚体,盐离子等杂质。

Q:产品可以重复使用吗?

A:产品不可以重复使用,乙醇洗脱步骤将影响磁珠表面活性基团性能。

Q:与AMPure XP相比,怎么样?

A:我们的产品制备原材料完全进口,可以完美替代AMPure XP Beads。在使用方法,文库大小分布和回收效率上,与AMPure XP Beads完全一致,您可以直接按照AMPure XP Beads的操作方式使用,无需摸索条件。

Q 磁珠可以吸附ssDNA吗?

A:可以回收单链DNA,具体性能没有测试过。附图是Beckman磁珠回收单链DNA的数据,可以作为参考。

图片.png

3. XP磁珠回收单链DNA效果图

Q 分选磁珠可以纯化gDNA吗?

A:翊圣分选磁珠测试过最大20kb的片段,回收率>90%。基因组 DNA 未测试过,测试时,由于大DNA与磁珠结合的非常紧,建议尽量增加洗脱液体积,避免干燥时间过久。

Q: 分选磁珠是否可以进行片段产物纯化?

A: 根据客户反馈结果,分选磁珠可以进行片段产物的纯化。0.8×磁珠可以吸附 200 bp 以上的产物,通过去除上清即可对 200 bp 以下的片段进行去除;1.4×磁珠可以吸附 150 bp 以上的产物,通过去除上清即可对 150 bp 以下的片段进行去除。

Q:磁珠的DNA结合能力怎么样?

A:在目前的磁珠体系中,磁珠的吸附能力均为过饱和,客户不必担心磁珠结合能力不足的情况。根据已知的报道,每μL磁珠可以结合μg DNA

Q 使用磁珠吸附小片段的时候,大片段也会吸附上来吗?

A: 磁珠优先吸附大片段,增大磁珠投入量时,磁珠会在吸附大片段的基础上增强吸附小片段的能力。

举例说明:参考磁珠纯化分选表,100 μL样本,加入80 μL磁珠Cat#12601,此时磁珠上吸附的是>350 bp的片段,但是,当磁珠投入量至100 μL时,磁珠上吸附的是>200 bp的片段。

Q分选磁珠是否可以用于提取DNA

 A:使用分选磁珠可以实现直接将样本裂解后用磁珠将其中的gDNA提取出来,可能效率没有专用试剂盒的高,因为我们这款磁珠的定位是在纯化和分选。

磁珠使用效果

Q:使用磁珠分选/纯化之后,还有小片段残留是怎么回事?

图片.png 

4. 二聚体残留效果图

A:小片段残留大部分是接头二聚体(127bp/引物二聚体(80bp)。若纯化,降低磁珠比例;若分选:可适当降低二轮磁珠比例可有效改善此类情况。

Q:磁珠回收率低可能的原因是什么?

A1)磁珠与DNA混匀不充分,未能充分吸附。建议反应体系充分混匀;

2)磁珠比例不对,建议按照说明书进行选择合适的比例;

3)孵育时间不足,保证孵育时间至少5 min

4)磁珠分选时,二轮磁珠吸附的时候吸到磁珠。可在200 μ枪头前串联 10μL枪头用于移液,可防止吸到磁珠;

5)磁珠洗涤时的乙醇非现配,导致乙醇浓度过低,建议乙醇浓度不低于70%

6)干燥过度:磁珠长时间干燥导致表面龟裂,DNA难以洗脱,得率降低;建议干燥时间不宜过长,表面刚出现龟裂即可;

7)洗脱液体积不足:最终洗脱液应完全覆盖管内磁珠。

Q:纯化后DNA在后续实验中表现不理想。

A:由乙醇残留引起,可能是操作时磁珠分离时间过短或磁力器磁力较弱,洗脱步骤中吸取上清速度过快等。建议确保在最后一步洗涤结束后,溶液中无残留乙醇。磁珠可于室温干燥5-10分钟,使乙醇完全干燥。

Q: 使用 12601 分选磁珠,分选出的文库大小不对称是怎么回事?

图片.png 

5. 分选文库大小不对称效果图

A:操作问题,磁珠比例应严格按照说明书,另外移液时为避免吸到磁珠,底部需残留 1-2μL 液体。


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产品类型

名称

货号

规格

价格

回收100-200 bp/100-400 bp

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